腈菌唑分子印跡固相萃取柱的制備及其在飼料檢測中的應(yīng)用

何叢薇，高林，趙春娟，高文惠*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

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腈菌唑分子印跡固相萃取柱的制備及其在飼料檢測中的應(yīng)用

何叢薇1，2，高林1，2，趙春娟1，2，高文惠1，2*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

本實(shí)驗(yàn)在制備腈菌唑分子印跡固相萃取柱的基礎(chǔ)上，建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜檢測飼料樣品中腈菌唑殘留的方法。以腈菌唑?yàn)槟０宸肿樱\(yùn)用本體聚合技術(shù)制備分子印跡固相萃取劑，裝填成柱，使用該柱對(duì)飼料樣品進(jìn)行萃取凈化，并采用高效液相色譜法對(duì)樣品中腈菌唑殘留進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)對(duì)固相萃取柱的制備條件和分離富集條件以及檢測條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，采用本方法對(duì)樣品處理選擇性強(qiáng)，樣品凈化效果好；腈菌唑線性范圍為0.3～200 μg/mL，平均回收率為88.6%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.54%～3.02%（n=5）。該方法能高選擇性、靈敏、快速、準(zhǔn)確地檢測樣品中腈菌唑殘留。

飼料；腈菌唑；分子印跡聚合物；固相萃取柱；高效液相色譜法

腈菌唑?qū)偃蝾悮⒕鷦?，具有?nèi)吸、保護(hù)和治療性，被認(rèn)為是一種前景較好的殺菌劑，近年來被廣泛使用。但飼料中腈菌唑殘留會(huì)直接或間接地對(duì)人體健康造成危害。為了最大限度地減小農(nóng)藥對(duì)人類的危害，建立高效、快速的農(nóng)藥殘留分析方法是科學(xué)指導(dǎo)農(nóng)藥使用的關(guān)鍵技術(shù)之一。

分子印跡技術(shù)（MIT）是高分子科學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科相結(jié)合獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一分子（模板分子）完全匹配聚合物的新實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。由于分子印跡聚合物（MIP）具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，耐受高溫、高壓、酸堿、有機(jī)溶劑等惡劣環(huán)境的能力，容易保存，制備簡便，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，較好的使用壽命等優(yōu)點(diǎn)（孟德欣等，2015），已在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、分離和色譜分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。其中，基于傳統(tǒng)固相萃取而發(fā)展起來的分子印跡固相萃取技術(shù)（MISPET），是近年來分子印跡研究的熱點(diǎn)之一（高文惠等，2014；胡靜等，2012）。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腈菌唑MIP制備分子印跡固相萃取柱，對(duì)飼料樣品進(jìn)行萃取凈化，并利用高效液相色譜法對(duì)經(jīng)過分子印跡固相萃取柱預(yù)處理的樣品進(jìn)行腈菌唑殘留檢測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑腈菌唑（純度為97.7%，江蘇耕農(nóng)化工有限公司）；丙烯酰胺（分析純，天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（分析純，撫順安信化學(xué)有限公司）；偶氮二異丁腈（化學(xué)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為三蒸水。

腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取腈菌唑0.01 g，置于50 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

樣品：豬飼料和牛飼料，均購自市場。

1.2儀器與設(shè)備LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）、ASE-12固相萃取儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）、TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用有限責(zé)任公司）、KH5200型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、HH-4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市宏華儀器廠）。

1.3方法

1.3.1分子印跡聚合物的制備將0.2 mmol腈菌唑和0.4 mmol丙烯酰胺（AM）放入50 mL的茄型瓶中，加致孔劑乙腈15 mL使其反應(yīng)，超聲1 h，再加交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）1.5 mL和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN）0.02 g。超聲30 min，混勻后通入N2脫氧15 min，再抽真空1 min后密封，在55℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，得塊狀固體MIP。經(jīng)研磨、粉碎，過200目篩，再用水沉降聚合物3次除去過細(xì)粉末。將最終得到的MIP顆粒用甲醇-乙酸（V∶V，95∶5）洗脫至無模板物質(zhì)，然后用甲醇浸泡1 h除去殘留的乙酸，洗脫后的聚合物放入真空干燥器中干燥6 h（45℃），得到以腈菌唑?yàn)槟０宸肿拥木酆衔颩IP。

1.3.2固相萃取柱的制備將制備好的腈菌唑MIP放入水中進(jìn)行沉降，充分去除過細(xì)粉末，然后均勻地填充到固相萃取柱中，在頂端加上少許脫脂棉，并輕輕按壓使填料緊實(shí)，使裝柱高度為2 cm。

將轉(zhuǎn)為H型的732型陽離子樹脂、大網(wǎng)孔吸附樹脂和硅膠三種填料分別填裝進(jìn)具砂芯層析柱內(nèi)，在頂端加少許脫脂棉，并輕輕按壓使填料緊實(shí)，使填料高度為2 cm。

1.4色譜條件色譜柱：Promosil C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），檢測波長210 nm，流動(dòng)相為甲醇-水（V∶V，80∶20），流速1 mL/min，柱溫25℃。

1.5樣品提取參照劉博等（2013）的方法，稱取5.000 g樣品，搗碎，用20 mL乙腈溶解（提取兩次），混勻，超聲15 min，于4000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL過分子印跡固相萃取柱，用20 mL水淋洗，待排凈淋洗液后，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用甲醇定容10mL后待測。

1.6分離富集（1）柱子活化。先用10 mL水將柱子浸濕，再用10 mL甲醇過柱，最后用10 mL水過柱。（2）上樣。吸取樣液1 mL上柱，控制固相萃取儀壓力為45 kPa。（3）淋洗。當(dāng)待測液全部過柱后，用20 mL水淋洗。（4）洗脫。用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，過0.45 μm的微孔濾膜，濾液待液相色譜分析。

2　結(jié)果與分析

2.1固相萃取柱裝柱高度的選擇本實(shí)驗(yàn)比較了腈菌唑分子印跡固相萃取柱裝柱高度分別為1、2、3 cm時(shí)柱對(duì)樣品的凈化和吸附能力的影響。當(dāng)裝柱高度大于3 cm時(shí)，柱壓增加，需要在更高的壓力下進(jìn)行洗脫，這樣既耗費(fèi)洗脫劑，又會(huì)增加洗脫時(shí)間。當(dāng)裝柱高度為1 cm時(shí)，模板物質(zhì)不能全部被吸附在萃取柱上，即柱吸附容量偏低。當(dāng)裝柱高度為2 cm時(shí)，與3 cm柱高相比，吸附、凈化效果相當(dāng)，且這時(shí)柱壓較低，操作方便快速，因此選擇裝柱高度為2 cm。

2.2固相萃取柱柱壓的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了柱壓分別為10、20、30、45、55 kPa時(shí)對(duì)樣品凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在10、20、30、45 kPa柱壓下，樣品的凈化效果相同，但柱壓越低，樣品處理速度越慢。而在55 kPa柱壓下，過液速度大于目標(biāo)物在聚合物上的解析速度，當(dāng)洗脫液全部通過后，目標(biāo)物在聚合物中仍有殘留，導(dǎo)致洗脫效果差。因此為了節(jié)省前處理時(shí)間提高效率，選擇45 kPa柱壓下進(jìn)行樣品前處理。

2.3淋洗液用量的選擇選用填料高度2 cm的分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行萃取凈化處理，以水作為淋洗劑，考察了不同用量的淋洗劑對(duì)樣品中雜質(zhì)的淋洗效果。于固相萃取柱中加入1 mL樣品原液，分別用5、10、15、20、25 mL的水進(jìn)行淋洗，收集各淋洗液，用高效液相色譜儀檢測。結(jié)果為淋洗液用量是20 mL時(shí)，不僅能將樣品中雜質(zhì)淋洗干凈，同時(shí)也不會(huì)造成淋洗液的浪費(fèi)。

2.4洗脫劑及其用量的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈兩種洗脫劑，并在其他條件相同的情況下進(jìn)行洗脫，將收集的洗脫液上機(jī)檢測，按照1.4色譜條件測定。由圖1看出，甲醇的洗脫能力強(qiáng)于乙腈，兼顧溶劑毒性和價(jià)格因素，因此選擇甲醇為洗脫劑。

圖1　不同洗脫液色譜圖

為考察了不同用量的洗脫劑對(duì)樣品中目標(biāo)物質(zhì)的萃取效果的影響。向固相萃取柱中加入1 mL濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用5、10、15、20、25 mL的甲醇進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液，用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液用量大于10 mL時(shí)，已經(jīng)不能檢測到目標(biāo)物質(zhì)，說明10 mL洗脫液可以完全將目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來，并且不會(huì)造成洗脫劑的浪費(fèi)，故本實(shí)驗(yàn)最佳洗脫劑用量為10 mL。

2.5不同固相萃取柱萃取效果的比較實(shí)驗(yàn)以陽離子交換樹脂、大網(wǎng)孔吸附樹脂、硅膠以及腈菌唑分子印跡聚合物分別作為固相萃取劑，比較其對(duì)腈菌唑的吸附能力，按照1.4色譜條件測定。

將200 μg/mL的腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液上樣1 mL，用20 mL水淋洗，10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液待上機(jī)檢測。

由圖2可知，腈菌唑分子印跡固相萃取柱對(duì)腈菌唑的吸附能力最高，表明腈菌唑分子印跡固相萃取柱對(duì)腈菌唑具有優(yōu)越的吸附性能，其主要原因是該柱對(duì)模板物質(zhì)具有特異性識(shí)別能力，所以對(duì)模板物質(zhì)的選擇吸附能力強(qiáng)。

圖2　腈菌唑過柱后洗脫液色譜圖

2.6液相色譜流動(dòng)相的選擇本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水作為流動(dòng)相，分別考察了不同配比的甲醇-水（體積比分別為100∶0、90∶10、80∶20和70∶30）對(duì)腈菌唑保留行為的影響。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例較高（100%甲醇或90%甲醇）時(shí)，腈菌唑出峰快；甲醇與水體積比較小時(shí)（70∶30），則腈菌唑保留時(shí)間偏長；當(dāng)甲醇與水體積比為80∶20時(shí)，腈菌唑保留時(shí)間適宜，不易受溶劑影響，如圖3所示。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇體積比為80∶20的甲醇-水為流動(dòng)相。

2.7線性關(guān)系與檢出限將腈菌唑儲(chǔ)備液分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.4色譜條件下進(jìn)行測定，然后繪制腈菌唑的線性關(guān)系曲線。結(jié)果表明，線性方程為y=32466.17x+23454.15（R=0.9999），線性范圍為0.3～200 μg/mL，檢出限為0.1 μg/mL。可見，腈菌唑線性范圍寬，檢測靈敏度較高。

圖3　腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.8腈菌唑分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品凈化和吸附能力測定分子印跡固相萃取柱利用非共價(jià)鍵對(duì)目標(biāo)物吸附，通過淋洗劑將雜質(zhì)去除，再使用洗脫劑將目標(biāo)物洗脫下來。從圖4與圖5對(duì)比可知，分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品凈化效果好，對(duì)雜質(zhì)不具有吸附能力。從圖6可知，分子印跡固相萃取柱只對(duì)模板物質(zhì)有吸附作用，表現(xiàn)出其從復(fù)雜基質(zhì)中特異性分離富集目標(biāo)物的優(yōu)越性能。

圖4　牛飼料樣品提取液色譜圖

圖5　牛飼料樣品提取液過柱后洗脫液色譜圖

圖6　牛飼料樣品加標(biāo)提取液過SPE柱后洗脫液色譜圖

2.9回收率和精密度實(shí)驗(yàn)采用本方法對(duì)豬飼料和牛飼料樣品在2 μg/mL和100 μg/mL 2個(gè)添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果如表1所示。由表1可見，樣品平均回收率為88.6%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.54%～3.02%（n=5）。說明方法的回收率和精密度良好。

表1　樣品回收率和精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）%

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以自制的腈菌唑分子印跡聚合物為固相萃取材料，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并利用高效液相色譜法測定樣品中腈菌唑殺菌劑殘留。結(jié)果表明，利用此分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，樣品凈化效果好，對(duì)腈菌唑特異吸附性強(qiáng)。腈菌唑的線性范圍為0.3～200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，檢出限為0.1 μg/mL；對(duì)食品和飼料樣品進(jìn)行分析，平均回收率為88.6%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.54%～3.02%（n=5）。該方法可應(yīng)用于質(zhì)檢和相關(guān)單位對(duì)食品或飼料中腈菌唑殺菌劑殘留的監(jiān)測。

［1］高文惠，王姣姣，賈英民.分子印跡固相萃取-液相色譜法測定食品中硝基呋喃類藥物殘留［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（9）：183～189.

［2］胡靜，吳曉燕，高文惠.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法分析2種三唑類殺菌劑殘留［J］.藥物分析雜志，2012，32（6）：1043～1047.

［3］劉博，尹航，劉文紅，等.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測飼料中聯(lián)苯三唑醇［J］.中國飼料，2013，15：33～34，43.

［4］孟德欣，劉志雙，于文瑄，趙寧.新型分子印跡聚合物的合成及其在食品安全中應(yīng)用的現(xiàn)狀［J］.科技視界，2015，20：17～18.

On the basis of preparation of myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction column，a method for determination of myclobutanil residues in feed samples was established by molecularly imprinted solid phase extraction-high performance liquid chromatography.Myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction agent was synthesized by bulk polymerization using myclobutanil as template molecule，and used to prepare myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction column.The extraction column was used to enrich myclobutanil in samples and cleanse samples，the cleaned samples were detected by high performance liquid chromatography.The selection of the extraction column preparation conditions，separation and enrichment conditions and detection conditions were investigated.The result showed that the method has good cleaning sample effect and strong selectivity，the linear range of myclobutanil was 0.3～200 μg/mL，the average recoveries were 88.6%～96.5%，the relative standard deviations（RSDs）were 1.54%～3.02%（n= 5）.The method was highly selective，sensitive，fast and accurate for determination of myclobutanil residues in samples.

feed；myclobutanil；molecularly imprinted polymer；solid phase extraction column；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2016）01-0024-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160108

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（14227504D、14236602D-13）