HPLC法同步測定維生素預混合飼料中5種B族維生素

梁琳，王英

（廣東省農業(yè)科學院農產品公共監(jiān)測中心，廣東廣州510640）

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HPLC法同步測定維生素預混合飼料中5種B族維生素

梁琳，王英

（廣東省農業(yè)科學院農產品公共監(jiān)測中心，廣東廣州510640）

本實驗建立同步測定維生素預混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1等5種B族維生素的高效液相色譜（HPLC）法。采用Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），流動相為pH 3.0的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸鈉-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脫，柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min，紫外檢測器在波長275 nm進行檢測，外標法定量。結果表明，煙酸和煙酰胺的線性范圍為75～1500 μg/mL，維生素B6、維生素B2和維生素B1的線性范圍為25～500 μg/mL，線性相關系數(shù)為0.9996～0.9999，平均回收率為98.5%～100.6%，相對標準偏差（RSD）為0.21%～0.61%。此方法具有簡單、快速和準確的特點，適用于維生素預混合飼料中5種B族維生素含量的同步測定。

高效液相色譜法；維生素預混料；B族維生素

B族維生素是一組重要的水溶性維生素。煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1同屬B族維生素，參與動物體內糖、脂肪、蛋白質等營養(yǎng)物質的代謝，在強化免疫系統(tǒng)、增強抗應激能力、預防疾病、提高繁殖性能、改善畜產品品質等方面起著其他營養(yǎng)素不可替代的作用。B族維生素種類多，結構復雜，分析測定比較困難，應用高效液相色譜（HPLC）法測定水溶性維生素，樣品前處理簡單，分離速度快，特異性強，準確度高，可實現(xiàn)多種維生素組分的測定（王小峰，2015；邵桃玉和趙國琦，2007）。本實驗采用HPLC法，同時測定維生素預混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1。方法簡便、快速和準確，可滿足實際應用中對維生素預混合飼料產品檢測和質量監(jiān)控的需要。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀（配G1314B紫外檢測器）、HU20500B型數(shù)控超聲波清洗器、THZ-82A恒溫振蕩器、PHS-3C型酸度計、sartorius賽多利斯萬分之一天平。煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1標準品（SIGMA公司）。甲醇和乙腈，色譜純；三乙胺、乙酸、辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、KH2PO4，均為優(yōu)質純；Milli-Q超純水。

1.2色譜條件色譜柱：Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），柱溫：35℃。流動相為pH 3.0的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸鈉-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脫，流速：1.0 mL/min，紫外檢測波長：275 nm，進樣體積：20 μL。

1.3標準溶液的配制和測定混合標準儲備液：分別精密稱取標準品煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1各適量，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL流動相溶解，90℃水浴振蕩提取30 min，冷卻后用流動相定容至刻度，配制成每毫升含煙酸1.50 mg、煙酰胺1.50 mg、維生素B60.50 mg、維生素B20.50 mg、維生素B10.50 mg的混合標準品儲備液。

混合標準工作液：精密移取標準品儲備液，用流動相稀釋成每毫升含煙酸150 μg、煙酰胺150 μg、維生素B650.0 μg、維生素B250.0 μg、維生素B150.0 μg的混合標準品工作液。標準品圖譜見圖1。

圖1　5種維生素混合標準品色譜圖

1.4實驗樣品溶液的制備和測定準確稱取0.3～0.5 g維生素預混合飼料，精確至0.0001 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL水，90℃水浴振蕩提取30 min，冷卻后用水定容至刻度，搖勻過濾后為樣品液，HPLC上機測定，外標法計算含量。樣品圖譜見圖2。

圖2　維生素預混合飼料樣品色譜圖

2　結果

2.1系統(tǒng)適應性實驗在上述色譜條件下，5組分的出峰順序依次為煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1，保留時間分別為3.54、3.91、4.85、8.42、9.48 min，各組分之間的分離度為1.97、4.39、11.99、2.47，均大于1.5；理論踏板數(shù)依次為8106、5535、8059、7890、6391，均大于5000。證明柱效高和分離效果好。

2.2精密度取混合標準儲備液，稀釋10倍后連續(xù)進樣6次，得到5組分色譜峰面積的相對標準偏差（RSD），分別為煙酸0.20%、煙酰胺0.71%、維生素B60.25%、維生素B20.59%、維生素B10.14%，保留時間的RSD分別為煙酸0.16%、煙酰胺0.23%、維生素B60.46%、維生素B20.93%、維生素B11.12%，均小于2%。表明本方法精密度良好。

2.3線性關系及線性范圍以混合標準儲備液最高濃度，分別稀釋成2、5、10、20倍等5個濃度的系列標準溶液，每個濃度進樣20 μL，記錄色譜圖，以峰面積（Y）與濃度（X）進行線性回歸計算，結果見表1。

表1　5種維生素回歸方程和線性范圍

2.4回收率實驗為了考察方法的可靠性，在線性范圍內，分別添加高、中、低3個濃度水平的標準溶液，每個水平3個重復進行測定，結果5組分平均回收率均大于98%，RSD均小于2%（表2）。證明此方法準確可靠。

表2　5種水溶性維生素的回收率和相對標準偏差

3　分析與討論

3.1色譜柱的選擇對水溶性維生素進行分析，通常采用C18色譜柱，其保留性強、分離效果好（趙艷等，2015；王海霞，2007）。本實驗分別選用C18色譜柱長（250 mm×4.0 mm）、中（150 mm× 4.6 mm）、短（125 mm×4.0 mm）三種柱型測定樣品，結果中短柱峰的保留時間短，各組分不能很好分離，而長柱（250 mm×4.0 mm）的分離效果較好，能準確分離五組分，雖然長柱分離時間略長，但分離效果好，考慮對于多成分的檢測，最終選擇長柱。

3.2檢測波長的選擇將5種維生素對照品分別用紫外光譜掃描，得到各組分的最大吸收波長：煙酸和煙酰胺為265 nm，維生素B6為290 nm，維生素B2為270 nm，維生素B1為250 nm，因維生素B6和維生素B2的響應值比較高，綜合考慮選擇275 nm。

3.3流動相及離子對試劑的選擇參照崔蓉等（2005）的方法，流動相選擇磷酸二氫鉀緩沖鹽-甲醇體系，因緩沖鹽能調節(jié)流動相pH，起到緩沖作用，從而改變出峰時間，使被測物質在色譜體系中更穩(wěn)定；由于B族維生素在水中可以解離為帶電荷的離子，在流動相中加入離子對試劑，使其形成中性離子對，即可促進物質在色譜柱內分離，也對峰型起到改善作用。實驗對辛烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉兩種常用的離子對試劑進行比較，結果分離效果一致，只是維生素B2和維生素B1的出峰順序互換，因此本實驗選擇辛烷磺酸鈉。磷酸緩沖鹽和離子對試劑兩者聯(lián)用可達到多種維生素更好地分離。

3.4流動相pH的選擇調節(jié)流動性的pH可以控制維生素的電離，使其在色譜柱上有一定的保留，達到調節(jié)保留時間，控制分離度的目的（常湘娜等，2004）。因B族維生素在酸性條件下比較穩(wěn)定，所以選擇pH值為4.0、3.0和2.0三種情況下進行比較實驗，結果pH為3.0時分離效果較好。

3.5流動相配比的選擇比較甲醇體積分數(shù)分別為30%、25%和20%時的分離效果，當甲醇的體積分數(shù)為30%時，出峰時間太快，色譜峰保留時間太短，造成煙酸、煙酰胺和維生素B6無法分離，當甲醇體積分數(shù)為20%時，維生素B1色譜峰保留時間太長，而甲醇體積分數(shù)為25%時，各目標物在12 min內完全分離，且干擾小，最終確定甲醇的體積分數(shù)為25%。

3.6提取液的選擇維生素預混料是由多種維生素單體和載體混合而成，載體通常選用以淀粉為主要成分的玉米粉和麩皮，其維生素含量甚微，因此對維生素預混合飼料中維生素的測定，主要是測定其中所添加維生素單體的含量。尹江偉等（2000）報道了B族維生素提取的多種方法，包括酸溶液浸提、流動相及水溶解等。本實驗采用水、水-甲醇-乙酸混液（V/V/V，94∶50∶10）和流動相三種提取液進行比較，RSD均小于2%，證明檢測結果一致，可見水能完全將5組分溶解提取，故選擇最簡單、無污染的水作為提取液（表3）。

表3　三種提取液的比較結果（n=3）

3.7提取方式和提取時間的選擇采用90℃水浴振蕩和超聲波兩種方式提取，提取時間選擇20、30、40 min，從表4結果可見，超聲波提取法比90℃水浴振蕩提取法的測定結果低，估計是超聲波提取的溫度達不到5組分的完全溶解；同一提取法不同時間的檢測結果一致，RSD均小于2%，為了保證5組分維生素在含量高時能充分溶解，最后選擇90℃水浴振蕩30 min提?。ū?）。

表4　不同提取方法和時間比較結果

3.8樣品測定結果比對為了確定本方法測定結果的準確性，將本方法與國家標準方法進行比對。由表5結果可知，兩種方法測定結果的相對偏差分別為煙酰胺0.90%、維生素B60.06%、維生素B20.96%、維生素B10.30%，均小于1.0%，符合國

表5本方法與國標方法比對結果

g/kg維生素標示量本方法測定量國標方法測定量煙酰胺100109107維生素B68.008.138.14維生素B210.010.310.5維生素B15.005.095.06

家標準規(guī)定的相對偏差小于5.0%，證明本方法的測定結果準確可靠。

4　結論

本實驗建立了高效液相色譜法同步測定維生素預混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1等5種B族維生素，通過試驗條件的優(yōu)化，采用水為提取液，pH 3.0的磷酸二氫鉀緩沖鹽-甲醇體系（V/V，75∶25）為流動相，辛烷磺酸鈉作為離子對試劑，等度洗脫，紫外檢測器檢測，結果表明，此方法分離效果好，精密度高，回收率均大于98%，12 min內實現(xiàn)5種B族維生素的完全分離測定，為維生素預混料產品中5種B族維生素指標的同時監(jiān)控提供了一種簡單、快速和準確的檢測方法。

［1］常相娜，黃榮清，王正平，等.B族維生素測定方法研究進展［J］.科學技術與研究，2004，4：312～316.

［2］邵桃玉，趙國琦.高效液相色譜測定維生素的研究［J］.飼料工業(yè)，2007，28（18）：55～58.

［3］崔蓉，李皎，王洪瑋，等.水溶性維生素的高效液相色譜測定方法的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（1）：55～57.

［4］王小峰.高效液相色譜法測定預混料中維生素的研究［J］.價值工程，2015，7：284～285.

［5］王海霞.高效液相色譜法測水溶性維生素綜述［J］.湖南飼料，2007，1：37～39.

［6］尹江偉，蘇紅衛(wèi).高效液相色譜法同時測定水溶性維生素［J］.瀘州醫(yī)學院學報，2000，23（5）：425～427.

［7］趙艷，揚發(fā)樹，劉耀敏，等.反相高效液相色譜法測定預混料中3種水溶性維生素［J］.飼料研究，2015，1：55～57.

To develop a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination of five B-group vitamins including nicotinic acid，nicotinamide，and vitamin B6，B2，B1in vitamin premixes.HPLC analytical column was C18column，column temperature was 35℃.The mobile phase was pH 3.0（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L1-Octanesulfonic acid sodium salt-0.5%TEA）-methanol（V/V，75∶25）with gradient elution，The flow rate was 1.0 mL/min，The UV detection wawelength was 275 nm.The results showed that calibration curves of five vitamins were linear in the range of 75～1500 μg/mL for nicotinic acid and nicotinamide，25～500 μg/mL for vitamin B6，B2，B1，and the linear correlation coefficient was 0.9996～0.9999.the average recovery was 98.5%～100.6%，The relative standard deviations（RSD）were 0.21%～0.61%.The method was simple，rapid and accurate，and it was suitable for simultaneous detecting five B-group vitamins in vitamin premixes.

HPLC；vitamin premixes；B-group vitamins

中國·豬營養(yǎng)國際論壇

S816.17

A

1004-3314（2016）01-0021-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160107