細(xì)極鏈格孢發(fā)育及其侵染鐵皮石斛的顯微觀察

汪正紅，李　祥，楊文超，丁　麗，陳俊梅，薛春麗，潘正瓊，孔　瓊，楊申宣

（1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199；2.蒙自市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南蒙自 661199）

細(xì)極鏈格孢發(fā)育及其侵染鐵皮石斛的顯微觀察

汪正紅1，李祥1，楊文超1，丁麗1，陳俊梅1，薛春麗1，潘正瓊2，孔瓊1，楊申宣1

（1.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199；2.蒙自市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南蒙自 661199）

細(xì)極鏈格孢是引起鐵皮石斛黑斑病的病原菌。文章觀察病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育及其侵染鐵皮石斛葉片過(guò)程。結(jié)果表明：細(xì)極鏈格孢發(fā)育速度較快，通過(guò)傷口侵染寄主植物，并能在葉片上萌發(fā)、生長(zhǎng)和定殖，從而引起病害。分生孢子于12h時(shí)萌發(fā)，24h形成菌絲，第3-4d產(chǎn)生孢子梗，并在其上著生鏈狀分生孢子，第5-6d時(shí)產(chǎn)生大量菌絲和分生孢子，并布滿了整個(gè)傷口組織。

細(xì)極鏈格孢；發(fā)育；鐵皮石斛；侵染

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，在抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和治療白內(nèi)障等方面具有很好療效.［1］由于野生資源稀少不能滿足市場(chǎng)需求，人們開(kāi)始大規(guī)模種植，隨著種植面積擴(kuò)大和年限的延長(zhǎng)，鐵皮石斛上各種病害日益加重.據(jù)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)疫病、炭疽病、黑斑病、莖基腐病等為鐵皮石斛的主要病害，［2］其中由細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）引起的黑斑病在云南屏邊、文山、西雙版納、瀘西等鐵皮石斛種植基地尤為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)30-50%.細(xì)極鏈格孢不但能通過(guò)病原孢子或菌絲的機(jī)械壓力侵入寄主，還會(huì)在繁殖過(guò)程分泌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（毒素）對(duì)寄主植物產(chǎn)生危害，而這些代謝產(chǎn)物還會(huì)殘留與植物體內(nèi)，人類(lèi)食用后具有誘變和致癌的作用.［3］因此該病原菌不僅影響鐵皮石斛的生長(zhǎng)發(fā)育，還嚴(yán)重影響鐵皮石斛品質(zhì).

鐵皮石斛黑斑病的研究文獻(xiàn)較少，主要側(cè)重于病原菌鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)化學(xué)藥劑篩選等方面，［4-8］而關(guān)于病原菌是如何侵染鐵皮石斛葉片的文獻(xiàn)較少.因此本文選取鐵皮石斛葉片和細(xì)極鏈格孢菌種為試驗(yàn)材料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)極鏈格孢侵染鐵皮石斛葉片的過(guò)程，為進(jìn)一步研究病原菌的致病機(jī)制和病害防治提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1供試材料

選取鐵皮石斛黑斑病病原菌—細(xì)極鏈格孢為供試菌種；移栽馴化3個(gè)月的鐵皮石斛組培苗葉片為接種材料；所用培養(yǎng)基為清水瓊脂培養(yǎng)基和PCA（胡蘿卜200g、馬鈴薯200g、瓊脂17g、蒸餾水1000ml）.

1.2方法

1.2.1菌種培養(yǎng)及孢子懸浮液制作

將菌種接于PCA平板培養(yǎng)基上，置于27±1℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，光照強(qiáng)度為60%，光周期為L(zhǎng)：D=12：12，并用無(wú)菌水制成1×106個(gè)/ml孢子懸浮液.

1.2.2細(xì)極鏈格孢生長(zhǎng)發(fā)育情況觀察

取1mL孢子懸浮液涂抹于清水瓊脂培養(yǎng)基于1.2.1中培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別于不同的培養(yǎng)時(shí)間下取樣進(jìn)行顯微觀察.即將小段透明膠帶貼于接種了孢子懸浮液的清水瓊脂培養(yǎng)基上，隨后將膠帶取下置于載玻片上滴一滴蒸餾水，加蓋玻片在顯微鏡下觀察.

1.2.3細(xì)極鏈格孢菌對(duì)鐵皮石斛葉片的侵染過(guò)程

選取健康長(zhǎng)勢(shì)一致的鐵皮石斛葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，采用針刺法接種，每片葉片接種10ul孢子懸浮液（濃度為1×106個(gè)/ml），隨后將接種后的植株置于人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并于不同時(shí)間下取樣染色、脫色后進(jìn)行觀察。培養(yǎng)溫度為27±1℃，相對(duì)濕度99%，光照強(qiáng)度為60%，光周期為L(zhǎng)：D=12：12.

具體方法為：將取樣后的葉片放入染色液中煮沸5min，然后置于脫色液中脫色12h，以蒸餾水做浮載劑進(jìn)行顯微觀察.染色液配方：10ml甘油、10ml乳酸、10g苯酚、10mg甲基藍(lán)，幾種混合后溶于10ml蒸餾水中，加熱溶解.脫色液配方：0.15%三氯乙酸溶解于體積比為3：1乙醇和氯仿混合溶液中.［4］

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)極鏈格孢發(fā)育情況

在不同培養(yǎng)時(shí)間下，細(xì)極鏈格孢生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，具體情況見(jiàn)圖1.孢子在12h開(kāi)始萌發(fā)（圖1-B），形成單個(gè)或多個(gè)芽管；隨后芽管向各方向生長(zhǎng)，形成菌絲（圖1-C）；第4-5d時(shí)，菌絲生長(zhǎng)到后期分化形成顏色較深且粗壯的分生孢子梗，且著生有鏈狀分生孢子（如圖1-DE）.之后菌絲老化加重，顏色不斷加深，繁殖能力下降（圖1-F）.

圖1　細(xì)極鏈格孢菌在清水瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2細(xì)極鏈格孢菌對(duì)鐵皮石斛的侵染

2.2.1葉片侵染癥狀觀察

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)極鏈格孢在無(wú)傷口的鐵皮石斛葉片上發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，因此本文采用針刺法進(jìn)行接種.在有傷口的情況下，鐵皮石斛葉片被細(xì)極鏈格孢侵染后的發(fā)病過(guò)程（見(jiàn)圖2），對(duì)照不發(fā)病.并且該菌的發(fā)病病程較長(zhǎng)，于接種第4d時(shí)葉片呈現(xiàn)可見(jiàn)的淺黃色病斑，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，第7d時(shí)的葉片出現(xiàn)黃褐色病斑（圖2-B）；第12d時(shí)發(fā)病癥狀更加明顯，黑色圓形病斑，同時(shí)病部組織破裂并出現(xiàn)凹陷，（圖2-C）；第22d時(shí)，病斑周?chē)~片變黃，隨后整片葉片變黃脫落（圖2-D）.

圖2　細(xì)極鏈格孢侵染鐵皮石斛的發(fā)病情況

2.2.2細(xì)極鏈格孢菌對(duì)鐵皮石斛侵染的顯微觀察

將細(xì)極鏈格孢接種于鐵皮石斛葉片，12h后在葉片可觀察到剛萌發(fā)的分生孢子（圖3-B），第2d時(shí)萌發(fā)后的菌絲開(kāi)始向各個(gè)方向生長(zhǎng)，隨后形成茂密的菌絲（圖3-C）；第4d時(shí)，組織表面可觀察到很多菌絲，并侵入到寄主植物組織內(nèi)部，且菌絲分化形成大量的產(chǎn)孢梗（圖3-D）；第5d時(shí)在菌絲內(nèi)部觀察有大量的分生孢子產(chǎn)生（圖3-E）；第6d時(shí)，傷口處布滿大量菌絲和分生孢子，且可見(jiàn)癥狀較為明顯（圖3-F），這與觀察到的可見(jiàn)癥狀相吻合.同時(shí)細(xì)極鏈格孢在鐵皮石斛葉片上的侵染過(guò)程也與該菌的生長(zhǎng)發(fā)育具有一致性.

圖3　細(xì)極鏈格孢在鐵皮石斛葉片定殖后的顯微情況

3　小結(jié)與討論

細(xì)極鏈格孢是一種植物病原真菌，具有廣泛的寄主范圍，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，同時(shí)其代謝過(guò)程產(chǎn)生的毒素也給人類(lèi)的健康帶來(lái)危害.因此研究其致病機(jī)制對(duì)于該病的防治尤為重要.而在鐵皮石斛種植過(guò)程，嚴(yán)重制約其生產(chǎn)的重要病原菌即時(shí)黑斑病，該病在氣候合適的條件下發(fā)病率較高，造成鐵皮石斛的大量減產(chǎn)，因此本文對(duì)其病原的生長(zhǎng)發(fā)育和侵染過(guò)程進(jìn)行了觀察，以期為該病害的防治提供依據(jù).

通過(guò)染色后進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)極鏈格孢以單個(gè)分生孢子著陸于寄主植物組織表面，然后萌發(fā)并產(chǎn)生芽管，芽管可從孢子側(cè)面和頂端萌發(fā)，隨后從傷口侵入寄主植物體內(nèi)，該結(jié)果與蘋(píng)果鏈格孢和銀海棗鏈格孢的侵染過(guò)程具有一定相似性［9-10］；當(dāng)病原菌侵入寄主體內(nèi)后，分泌毒素（另文發(fā)表）或者酶，殺死和降解寄主組織，同時(shí)產(chǎn)生許多圍繞細(xì)胞間隙生長(zhǎng)的菌絲，在傷口周?chē)慕M織中擴(kuò)展，引起寄主組織解體，從而造成葉片黃化和脫落.

［1］郁美娟，孟慶華，黃德音，等.石斛屬植物有效成分及藥理作用研究［J］.中成藥，2003（11）：918-921.

［2］李戈，李榮英，高薇薇.藥用石斛規(guī)模化種植中的病害問(wèn)題及防治策略［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（4）：485-487.

［3］M. á. Pavón Moreno，I. González Alonso，R. Martín de Santos y，et al. The Importance of Genus Alternaria in Mycotoxins Production and Human Diseases［J］. Nutr Hosp. 2012，27（6）：1772-1781.

［4］張敬澤，鄭小軍.鐵皮石斛黑斑病病原菌的鑒定和侵染過(guò)程的細(xì)胞學(xué)研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2004，34（1）：92-94.

［5］桑維鈞，李小霞，練啟仙，等.赤水金釵石斛黑斑病菌生物學(xué)特性及防治研究［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（1）：90-93.

［6］王仕玉，蕭鳳回.齒瓣石斛病原鏈格孢菌生物學(xué)特性研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009：243-246.

［7］張敬澤，方鈺蓉，張海松，等.鐵皮石斛黑斑病菌室內(nèi)藥效試驗(yàn)［J］. 植物保護(hù)，2005，31（1）：44-47.

［8］曹星星.鐵皮石斛病原其菌分離與鑒定及印度梨形孢促生作用研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)，2015.

［9］張彩霞，陳瑩，李壯，等.蘋(píng)果鏈格孢菌與寄主葉片互作的超微結(jié)構(gòu)研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（1）：0106-0110.

［10］孫思，王軍.五種整葉透明染色法顯微觀察鏈格孢侵染銀海棗的比較試驗(yàn)［J］. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（5）：40，49.

［責(zé)任編輯 魯海菊］

Microscopic Observation on Development of Alternaria Tenuissima and Its Infection on Dendrobium Officinale

WANG Zheng-hong1，LI Xiang1，YANG Wen-chao1，DING Li1，CHEN Jun-mei1，XUE Chun-Li1，PAN Zheng-qiong2，KONG Qiong1，YANG Shen-xuan1
（1.College of Life Science and Technology，Honghe University，Mengzi 661199，China；2.Agricultural Techniques Extension Center of Mengzi City，Mengzi 661199，China）

Alternaria tenuissima was a pathogen of black spot in Dendrobium officinale. The development of Alternaria tenuissima and its infection process on leaves of Dendrobium officinale were observed in this paper. The results showed that growth rate of Alternaria tenuissima was fast，infected host by wound，then it could germinate and colonize on leaves of Dendrobium officinale. Conidia of Alternaria tenuissima germinated in 12h，hyphae forming in 24h，conidiophores producing in 3-4d of inoculation with some chain-like spores，then a large amount of hyphae and conidia were formed in 5-6d，and covering on wound tissue of host.

Alternaria tenuissima； Development； Dendrobium officinale； Infection

S432

A

1008-9128（2016）05-0049-03

10.13963/j.cnki.hhuxb.2016.05.013

2015-03-30

云南省教育廳項(xiàng)目（2015Y451）；紅河學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（DCXL1305）；紅河學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金（SZ1408）；紅河學(xué)院校級(jí)委托項(xiàng)目（13WT001）；紅河學(xué)院碩士點(diǎn)植物保護(hù)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；紅河學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)踐訓(xùn)練平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（CXSJ1304）

汪正紅（1993-），女，云南施甸人，紅河學(xué)院生命學(xué)院學(xué)生；李祥（1993-），男，云南富源人，紅河學(xué)院生命學(xué)院學(xué)生。

孔瓊（1976-），女，云南宣威人，副教授，博士，研究方向：植物抗病性研究。