沉默肝星狀細(xì)胞神經(jīng)菌毛素-1抑制肝癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

徐之超，陳　晨，慎浩鑫，馬　麗，李文智，王　林，耿智敏

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.急診科；2.肝膽外科，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

沉默肝星狀細(xì)胞神經(jīng)菌毛素-1抑制肝癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

徐之超1，陳晨2，慎浩鑫2，馬麗2，李文智2，王林2，耿智敏2

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.急診科；2.肝膽外科，陜西西安710061)

目的探討沉默肝星狀細(xì)胞神經(jīng)菌毛素-1(neuropilin-1,NRP-1)表達(dá)后，是否會(huì)影響其對(duì)肝癌的促生長(zhǎng)作用，并初步探討可能存在的作用機(jī)制。方法細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞熒光雙重染色觀察NRP-1在肝星狀細(xì)胞LX2中的表達(dá)及其與血小板源性生長(zhǎng)因子受體β(platelet-derivedgrowthfactorreceptor-β,PDGFR-β)的共表達(dá)；MTT法檢測(cè)沉默肝星狀細(xì)胞NRP-1后對(duì)肝癌細(xì)胞體外增殖能力影響；建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，繪制生長(zhǎng)曲線，免疫組化法觀察各組瘤體α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、NRP-1、PDGFR-β表達(dá)強(qiáng)度的差異。結(jié)果LX2表面存在NRP-1表達(dá)，且NRP-1與PDGFR-β共表達(dá)于LX2；沉默LX2NRP-1后對(duì)HepG2促增殖作用降低(P<0.05)；NRP-1KG移植瘤體積較NRP-1CG、NRP-1NG小(P<0.05)，進(jìn)一步對(duì)各組瘤體行免疫組化染色并進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度積分分析，發(fā)現(xiàn)NRP-1KG瘤體間質(zhì)NRP-1、PDGFR-β表達(dá)均較NRP-1CG弱(χ2=25.89，P<0.05；χ2=28.12，P<0.05)。結(jié)論沉默肝星狀細(xì)胞NRP-1表達(dá)后，其對(duì)肝癌細(xì)胞促增殖作用降低，在體內(nèi)環(huán)境中其對(duì)肝癌皮下移植瘤促生長(zhǎng)作用也降低，其機(jī)制與肝星狀細(xì)胞活化減弱有關(guān)，而肝星狀細(xì)胞NRP-1表面共受體PDGFR-β表達(dá)減弱也可能參與這一過程。

神經(jīng)菌毛素-1；肝星狀細(xì)胞；肝癌；腫瘤微環(huán)境

肝癌微環(huán)境中除了肝癌細(xì)胞(hepatocellularcarcinomacells,HCCs)，還包括多種間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分，這些間質(zhì)成分一定程度上決定腫瘤的發(fā)生發(fā)展。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells,HSCs)作為肝癌微環(huán)境主要間質(zhì)細(xì)胞之一，在血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)等細(xì)胞因子作用下，轉(zhuǎn)化為活化的HSC，自身增殖能力增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展[1-2]。同時(shí)，活化的HSC自分泌PDGF能力增強(qiáng)，反過來又可促進(jìn)自身活化。神經(jīng)菌毛素-1(neuropilin-1,NRP-1)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達(dá)于多種細(xì)胞，可促進(jìn)大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究證實(shí)，沉默HCCNRP-1表達(dá)可抑制其增殖能力[3]。我們前期研究證實(shí)，NRP-1可通過促進(jìn)HSCs活化來增強(qiáng)HCC增殖、遷移及侵襲能力[4]。那么沉默HSCsNRP-1表達(dá)，體內(nèi)外環(huán)境下其對(duì)HCC促增殖作用是否會(huì)降低，目前還未見研究報(bào)道。本研究在觀察HSCsNRP-1表達(dá)及NRP-1與PDGFR-β共表達(dá)的基礎(chǔ)上，探討沉默HSCsNRP-1表達(dá)對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響，并進(jìn)一步分析可能存在的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑DMEM、新生胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗Neuropilin-1兔抗人抗體、抗α-SMA兔抗人抗體、抗PDGFR-β兔抗人抗體、抗PDGFR-β猴抗人抗體、羊抗兔二抗、羊抗兔熒光二抗、羊抗猴熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2細(xì)胞系及裸鼠人肝癌細(xì)胞系HepG2由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室提供，人肝星狀細(xì)胞系LX2購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。上述兩種細(xì)胞均以含100mL/L新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，置于50mL/LCO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4周齡BALB/C裸鼠，SPF級(jí)別，雌雄各半，平均體質(zhì)量(20±5)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)同意。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞免疫熒光及激光共聚焦取5×103/mL密度肝星狀細(xì)胞500μL接種于24孔板，培養(yǎng)24h后PBS清洗，多聚甲醛固定，再漂洗，封閉,加入一抗(兔抗人NRP-1，羊抗人PDGFR-β)，孵育2h后加入二抗(避光條件下操作)，漂洗，加入DAPI后再加入封片劑并迅速在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.2慢病毒轉(zhuǎn)染及Westernblot檢測(cè)NRP-1蛋白表達(dá)應(yīng)用前期已構(gòu)建的慢病毒pGCSIL-RFPshNRP1[5]。接種5×103個(gè)LX2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，24h后按照設(shè)定感染復(fù)數(shù)加入稀釋的病毒液及5μg/mLpolybrene，其中轉(zhuǎn)染慢病毒空載體LX2為NRP-1CG(NRP-1controlgroup)，轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的LX2為NRP-1KG(NRP-1knockdowngroup)，未轉(zhuǎn)染慢病毒載體的LX2為NRP-1NG(NRP-1normalgroup)，72h后觀察感染效果。轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)一定量后提取蛋白，應(yīng)用Westernblot檢測(cè)NRP-1蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，采用ECLTMWesternblot分析系統(tǒng)顯影。

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將HepG2細(xì)胞以1×105/mL密度(無血清培養(yǎng)基稀釋)取100μL分別接種于3張96孔板(包含調(diào)零孔和對(duì)照孔)，分別加入不同組LX2無血清上清液(離心后收集)，未加LX2上清液HepG2組為HCCG；于24、48、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取一張96孔板加入新鮮配置的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h并棄上清液后加DMSO搖床振蕩，20min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀選擇490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值。

1.3.4裸鼠肝癌皮下移植瘤的建立將24只裸鼠隨機(jī)分組為NRP-1KG(NRP-1KG組肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞混懸液)、NRP-1CG(NRP-1CG組肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞混懸液)、NRP-1NG(NRP-1NG組肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞混懸液)及HCCG組(單純注射肝癌細(xì)胞懸液)。分別于裸鼠腋窩皮下注射LX2(2×105)與HepG2(1×106)細(xì)胞混懸液或HepG2(1×106)，建立皮下移植瘤模型。注射后第7日開始，每隔1周測(cè)量4組中每只裸鼠移植腫瘤長(zhǎng)徑及與短徑，計(jì)算其體積(V=長(zhǎng)徑×短徑×短徑/2)及平均體積。4周后取材。

1.3.5免疫組化觀察裸鼠瘤體NRP-1與PDGFR-β表達(dá)不同瘤體組織標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、包埋后制成厚度為5μm切片。再經(jīng)脫蠟、水化、漂洗，依次孵育NRP-1單克隆抗體(1∶100)或者PDGFR-β(1∶50)、二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為已知Neuropilin-1或PDGFR-β，最后于顯微鏡下觀察。陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野，對(duì)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分。著色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比，0分為百分比為0，1分為0～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。上述計(jì)分結(jié)果相加，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為中等陽(yáng)性()，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。對(duì)兩組或多組計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1NRP-1在LX2中的表達(dá)及其與PDGFR-β在LX2中共表達(dá)情況NRP-1表達(dá)于多種細(xì)胞表面，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)可觀察到LX2細(xì)胞表面NRP-1表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜。細(xì)胞熒光雙重染色可觀察到PDGFR-β在LX2也有表達(dá)，且兩者共表達(dá)于LX2細(xì)胞膜(圖1)。

圖1NRP-1在LX2中的表達(dá)及其與PDGFR-β的共表達(dá)

Fig.1ExpressionofNRP-1andco-expressionwithPDGFR-βinhepaticstellatecells

A：紅色熒光表示NRP-1表達(dá)(×200)；B：綠色熒光表示PDGFR-β表達(dá)(×200)；Merge：黃色熒光表示NRP-1與PDGFR-β共表達(dá)(×400)

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染LX2感染復(fù)數(shù)復(fù)核及NRP-1蛋白的表達(dá)當(dāng)MOI=30時(shí)LX2感染細(xì)胞數(shù)基本達(dá)到80%以上，可以將30確定為慢病毒感染LX2的感染復(fù)數(shù)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照MOI為30感染LX2，對(duì)NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NGLX2應(yīng)用Westernblot檢測(cè)NRP-1表達(dá)，結(jié)果顯示NRP-1KG組NRP-1表達(dá)降低(圖2，P<0.05)，證實(shí)了我們構(gòu)建的慢病毒載體NRP-1shRNA可以有效沉默LX2NRP-1表達(dá)。

圖2Westernblot檢測(cè)NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NGLX2細(xì)胞NRP-1的表達(dá)

Fig.2LX2NRP-1expressionofNRP-1KG,NRP-1CG,andNRP-1NGdetectedbyWesternblot

2.3ShRNA干擾LX2NRP-1表達(dá)后對(duì)HepG2增殖能力的影響為了檢測(cè)沉默LX2NRP-1后對(duì)HepG2增殖能力影響，對(duì)NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NG及HCCG各組應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72h)的吸光度(A值)變化。結(jié)果顯示，NRP-1KG吸光值較NRP-1CG低，NRP-1NG吸光值較HCCG組高(圖3，P<0.05)。說明LX2可以促進(jìn)HepG2的增殖能力，而沉默LX2NRP-1表達(dá)后，其對(duì)HepG2的促增殖作用減弱。

圖3HepG2不同組吸光值柱狀圖

Fig.3AvalueofNRP-1indifferentgroups*P<0.05。

2.4裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況裸鼠肝癌皮下移植瘤模型建立后，從注射后第7天開始，每周測(cè)量4組中各只裸鼠移植腫瘤長(zhǎng)徑及與短徑，28d后處死裸鼠，計(jì)算每周瘤體體積并繪制生長(zhǎng)曲線(圖4)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，NRP-1KG組瘤體體積較NRP-1CG和NRP-1NG組小(P<0.05)，HCCG組瘤體體積小于NRP-1CG與NRP-1NG組(P<0.05)，表明在體內(nèi)環(huán)境下LX2可促進(jìn)HepG2增殖，而沉默NRP-1LX2對(duì)HepG2促增殖作用降低。

2.5皮下移植瘤小動(dòng)物的成像情況對(duì)NRP-1KG、NRP-1CG兩組裸鼠處死前進(jìn)行小動(dòng)物成像，兩組隨機(jī)選取面積及背景相同區(qū)域，得到熒光強(qiáng)度值總和。結(jié)果顯示，兩組腫瘤組織內(nèi)熒光強(qiáng)度不同(圖5)，相同區(qū)域內(nèi)NRP-1KG熒光值低于NRP-1CG熒光強(qiáng)度(P<0.05)，說明NRP-1KG瘤體中LX2數(shù)目低于NRP-1CG。

圖4裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況

Fig.4Growthofsubcutaneouslytransplantedtumorinnudemice

A：不同組裸鼠皮下成瘤；B：不同組移植瘤瘤體；C：不同組裸鼠瘤體生長(zhǎng)曲線。黑箭頭為移植瘤瘤體，*P<0.05。

圖5裸鼠成像圖及兩組熒光強(qiáng)度的比較

Fig.5Nudemiceimagingandcomparisonoffluorescenceintensityinthetwogroups

A、B：NRP-1KG；C、D：NRP-1CG。*P<0.05。

2.6移植瘤體免疫組化檢測(cè)結(jié)果NRP-1KG、NRP-1CG、NRP-1NG各組HE染色可見腫瘤間質(zhì)較多，并分隔、包繞腫瘤組織形成多個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心有時(shí)可以看到壞死的腫瘤組織，周邊為未壞死的腫瘤組織，NRP-1KG較多見。各組瘤體α-SMA染色后可見不同組別之間α-SMA表達(dá)情況不同(圖6)。為進(jìn)一步比較不同組間質(zhì)中NRP-1與PDGFR-β表達(dá)情況，各組染色后分別進(jìn)行人工計(jì)數(shù)排除肝癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，NRP-1KG組間質(zhì)細(xì)胞NRP-1與PDGFR-β表達(dá)低于NRP-1CG組(P<0.05，圖7、圖8、表1、表2)。

圖6各組α-SMA的免疫組化染色

Fig.6α-SMAexpressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG組；B：NRP-1CG組；C：NRP-1NG組；D：HCCG。

3　討　　論

NRP-1作為多種細(xì)胞因子共受體，可促進(jìn)細(xì)胞因子與其受體結(jié)合，放大下游信號(hào)傳導(dǎo)，參與血管形成、腫瘤生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)等過程[6-8]。既往多項(xiàng)研究已證實(shí)，HSCs在體內(nèi)外環(huán)境下可促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)，并可將HSCs作為肝癌靶向治療靶標(biāo)及評(píng)估肝癌患者預(yù)后指標(biāo)之一[9]。目前關(guān)于HSCs促HCC增殖相關(guān)機(jī)制的研究較多，如HSCs促進(jìn)FAK-MMP9信號(hào)傳導(dǎo)[10]，分泌TGF、PDGF、VEGF、MMP-2、MMP-9[11-12]，促進(jìn)骨橋蛋白形成[13]，參與肝癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生[14]等多種不同機(jī)制。除上述機(jī)制，HSCs還可以通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸和肝癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)間接促進(jìn)肝癌發(fā)展[15-17]。我們體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSCs促進(jìn)HCC增殖及肝癌生長(zhǎng)同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)沉默HSCsNRP-1表達(dá)，其對(duì)HCC促增殖作用降低，這提示我們HSCsNRP-1基因可以考慮作為肝癌靶向治療的靶點(diǎn)之一。而關(guān)于沉默HSCsNRP-1表達(dá)后，通過何種機(jī)制影響肝癌生長(zhǎng)，目前還未見相關(guān)報(bào)道。我們推測(cè)，這一作用機(jī)制可能是通過影響HSCs活化狀態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌及細(xì)胞表面部分受體表達(dá)改變，進(jìn)一步影響肝癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)促增殖信號(hào)傳導(dǎo)。由于HSCs活化的重要標(biāo)志是α-SMA表達(dá)，α-SMA表達(dá)強(qiáng)度越弱，HSCs活化程度越弱，對(duì)肝癌間接促生長(zhǎng)作用也降低。隨后，我們對(duì)各組瘤體進(jìn)行α-SMA免疫組化染色可觀察到各組均有表達(dá)，但表達(dá)范圍及強(qiáng)度不同，尤其是NRP-1KG與NRP-1CG兩組。HCCG瘤體內(nèi)僅有少量表達(dá)或不表達(dá)α-SMA。這說明沉默LX2NRP-1表達(dá)后對(duì)肝癌促生長(zhǎng)作用降低的機(jī)制之一是LX2活化狀態(tài)發(fā)生改變，當(dāng)然這也需要后期Westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7各組NRP-1的免疫組化染色

Fig.7NRP-1expressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG組；B：NRP-1CG組；C：NRP-1NG組；D：HCCG組。

圖8各組PDGFR-β的免疫組化染色

Fig.8PDGFR-βexpressionindifferentgroupsbyimmunohistochemistry(DAB, ×200)

A：NRP-1KG組；B：NRP-1CG組；C：NRP-1NG組；D：HCCG組。

表1兩組間質(zhì)細(xì)胞NRP-1表達(dá)的人工計(jì)數(shù)結(jié)果分析

Tab.1ArtificialcountinganalysisofNRP-1expressioninmesenchymalcellsinthetwogroups

NRP-1表達(dá)NRP-1KG(個(gè)/視野)NRP-1CG(個(gè)/視野)總和χ2值P值-303+2110316162204425.89<0.001

表2兩組間質(zhì)細(xì)胞中PDGFR-β表達(dá)的人工計(jì)數(shù)結(jié)果分析

Tab.2ArtificialcountinganalysisofPDGFR-βexpressioninmesenchymalcellsinthetwogroups

PDGFR-β表達(dá)NRP-1KG(個(gè)/視野)NRP-1CG(個(gè)/視野)總和χ2值P值-527+204245182306628.12<0.001

研究中我們對(duì)NRP-1KG與NRP-1CG兩組裸鼠處死前進(jìn)行小動(dòng)物成像，取相同大小及背景統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)兩組熒光強(qiáng)度不同，提示在體內(nèi)環(huán)境下沉默HSCsNRP-1表達(dá)后，HSCs自身增殖能力減弱。由于HCC與HSCs之間對(duì)話是相互的，HSCs可以促進(jìn)HCC增殖，反過來HCC也可以促進(jìn)HSCs的活化增殖[18]。因此，NRP-1KGHSCs數(shù)目相對(duì)較少也需要考慮由于肝癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞對(duì)沉默NRP-1表達(dá)后的HSCs促增殖能力減弱有關(guān)，但后者作用相對(duì)較弱。

體外研究可觀察到LX2細(xì)胞表面NRP-1與PDGFR-β共定位表達(dá)，體內(nèi)研究中兩者在NRP-1KG、NRP-1CG及NRP-1NG瘤體肝癌實(shí)質(zhì)高表達(dá)，而在間質(zhì)中NRP-1KG表達(dá)比例較低，NRP-1CG及NRP-1NG間質(zhì)中表達(dá)比例較高。在HCCG除了肝癌實(shí)質(zhì)較高表達(dá)外，間質(zhì)幾乎沒有表達(dá)或少量表達(dá)NRP-1與PDGFR-β。NRP-1KG可見少量NRP-1表達(dá)，主要是由于對(duì)LX2轉(zhuǎn)染效率并非100%及部分LX2轉(zhuǎn)染后NRP-1未被完全有效沉默。同樣，PDGFR-β在肝癌細(xì)胞均呈現(xiàn)高表達(dá)，在各組間質(zhì)細(xì)胞中NRP-1KG間質(zhì)中表達(dá)比例較低，NRP-1CG及NRP-1NG間質(zhì)中PDGFR-β表達(dá)比例較高，這與CAO等[19]證實(shí)HSCs中NRP-1的高表達(dá)與PDGFR-β高表達(dá)具有相關(guān)性的結(jié)論一致。而PDGFR-β高表達(dá)是否會(huì)影響肝癌細(xì)胞增殖，目前也同樣未見相關(guān)報(bào)道，但PDGFR-β高表達(dá)是會(huì)影響HSCs自身活化過程，這也會(huì)間接影響肝癌細(xì)胞增殖。

理想的分子靶向治療是僅作用于腫瘤細(xì)胞本身，而由于在大多數(shù)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞也會(huì)表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白，那么了解目的基因蛋白在腫瘤微環(huán)境中所發(fā)揮的作用顯得尤為重要。本研究證實(shí)了沉默HSCsNRP-1表達(dá)會(huì)抑制肝癌細(xì)胞增殖，那么以NRP-1為靶點(diǎn)的分子治療不僅會(huì)抑制肝癌本身，也會(huì)抑制肝癌微環(huán)境中相關(guān)促癌成分，這為后期進(jìn)一步探究肝癌靶向治療靶點(diǎn)提供了方向和思路。

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(編輯卓選鵬)

Silencingneuropilin-1expressionofhepaticstellatecellsinhibitsthegrowthofhepatocellularcarcinoma

XUZhi-chao1,CHENChen2,SHENHao-xin2,MALi2,LIWen-zhi2,WANGLin2,GENGZhi-min2

(1.EmergencyDepartment; 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveToinvestigatewhethertheexpressionofhepaticstellatecellsneuropilin-1silenced(NRP-1)affectsthegrowthofhepatocellularcarcinomacells(HCCs)andtoexplorethepossiblemechanism.MethodsExpressionofNRP-1andco-expressionwithplatelet-derivedgrowthfactorreceptor-β(PDGFR-β)inhepaticstellatecellswereobservedbyimmunofluorescenceandfluorescentdoublestaining.TheeffectofsilencingNRP-1ofHSCsontheproliferationofHCCcellswasdetectedbyMTTin vitro.Axenografthepatocellularcarcinomamodelofnudemousewasestablishedsubcutaneously.Thegrowthcurvewasdrawnandtheexpressionsofα-SMA,NRP-1andPDGFR-βintumorswereobservedbyimmunohistochemistrystainingafterthemicewerekilled.ResultsNRP-1wasexpressedinthemembraneofLX2andwasco-expressedwithPDGFR-β.SilencingNRP-1ofLX2reducedtheproliferationofHepG2 in vitro (P<0.05).ThetumorvolumeinNRP-1KGgroupreducedobviouslycomparedwiththatinNRP-1CGgroup(P<0.05).TheexpressionsofNRP-1andPDGFR-βinNRP-1KGgroupwereweakerthanthoseinNRP-1CGgroupbyimmunohistochemistry(χ2=25.89, P<0.05; χ2=28.12, P<0.05).ConclusionSilencingNRP-1expressionofHSCscandecreaseitseffectontheproliferationofHCCsin vitroandthegrowth-promotingeffectofHSCsonHCCsisalsodecreasedin vivo,whichisduetotheinhibitionofHSCsactivation,andthedecreasedexpressionofco-receptorPDGFR-βmayplayaroleinthisprocess.

neuropilin-1;hepaticstellatecell;hepatocellularcarcinoma;tumormicroenvironment

2015-06-05

2016-04-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30971340)

耿智敏.E-mail:gengzhimin@mail.xjtu.edu.cn

R735.7

A

10.7652/jdyxb201605007

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30971340)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160802.1150.010.html(2016-08-02)