S100A6 siRNA的構(gòu)建及鑒定

馮珊珊，楊　博，劉愛琴，武　婧，翟惠虹

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院：1. 外科學(xué)研究室；2. 消化內(nèi)科，寧夏銀川　750004)

?

◇技術(shù)方法研究◇

S100A6siRNA的構(gòu)建及鑒定

馮珊珊1，楊博2，劉愛琴2，武婧2，翟惠虹2

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院：1. 外科學(xué)研究室；2. 消化內(nèi)科，寧夏銀川750004)

目的利用小片段干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表達(dá)，為研究CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制提供有利的工具。方法設(shè)計(jì)S100A6的siRNA序列，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，用Real-timePCR及Westernblot方法檢測(cè)S100A6在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果構(gòu)建了3對(duì)S100A6-siRNA，熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞成功；RT-PCR證明了在SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；Westernblot證明了SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與S100A6si-1、S100A6si-3組相比，S100A6si-2組對(duì)S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明顯(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了S100A6-siRNA，為CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供了有利的工具。

結(jié)腸癌；S100A6；siRNA；鈣周期素結(jié)合蛋白

鈣周期素結(jié)合蛋白[calcyclin(S100A6)-binding-protein,CacyBP]是1998年從小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的以鈣依賴方式結(jié)合S100A6的蛋白[1]；2001年發(fā)現(xiàn)一種人Siah-1結(jié)合蛋白(Siah-1interactingprotein,SIP)與CacyBP序列相同，從此命名為CacyBP/SIP[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中高表達(dá)[3-4]。研究還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CacyBP/SIP在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，給予胃泌素[4-5]、表皮生長(zhǎng)因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激后，CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[4]，且CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后可能與核內(nèi)的細(xì)胞周期調(diào)控因子結(jié)合[9]。細(xì)胞核是細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、分化及遺傳物質(zhì)的調(diào)控中心。因此，CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不明確。根據(jù)CacyBP/SIP結(jié)構(gòu)分析，CacyBP/SIP通過Ca2+可以結(jié)合S100蛋白家族中的S100A1、S100A6、S100B、S100P[10]。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S100A6可能導(dǎo)致CacyBP/SIP發(fā)生依賴Ca2+濃度方式的核轉(zhuǎn)位。因此，本研究通過S100A6-siRNA的構(gòu)建及鑒定，為CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供有利的工具。

1　材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù))；S100A6-siRNA(上海吉瑪公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)；小鼠抗人S100A6單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(Santa公司)；SYBRGreenPCRMasterMix(ABI公司)；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(Fermentas公司)；LipofectamineTM2000、Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；DNA引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞用含有100mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的IMEM培養(yǎng)液，37 ℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，48h更換1次培養(yǎng)液，用2.5g/L胰酶消化傳代，細(xì)胞傳代3～4次后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2S100A6-siRNA引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank提供的S100A6基因cDNA序列(編號(hào)GI：NM_014624)，選擇S100A6的靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1S100A6-siRNA序列

Tab.1SequenceofS100A6-siRNA

GenesiRNAsequenceTargetsites陰性對(duì)照組Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Anti-sense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'S100A6si-1Sense:5'-GCGAAUGUGCGUUGUGUAATT-3'Anti-sense:5'-UUACACAACGCACAUUCGCTT-3'120～138S100A6si-2Sense:5'-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3'Anti-sense:5'-ACUUGUGGAAGAUGGCCACTT-3'349～367S100A6si-3Sense:5'-CCUCUCUGAGUCAAAUCCATT-3'Anti-sense:5'-UGGAUUUGACUCAGAGAGGTT-3'624～642

1.2.3基因轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，以(5～6)×104/孔細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換無抗生素培養(yǎng)基過夜。按照LipofectamineTM2000步驟轉(zhuǎn)染siRNA，將7.5μL標(biāo)記熒光素的陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后更換無抗生素的完全培養(yǎng)液，24～72h內(nèi)熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4Real-timePCR檢測(cè)S100A6-siRNA效率本實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、S100A6si-1組、S100A6si-2組、S100A6si-3組，檢測(cè)轉(zhuǎn)染72h后各組細(xì)胞S100A6的mRNA表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參，采用Primer4.0軟件設(shè)計(jì)引物[10](表2)。分別提取各組細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBRGreenⅠ熒光染料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性，5min；94 ℃變性，20s；退火59 ℃，20s；延伸72 ℃，20s；40個(gè)循環(huán)。采用Real-timePCR中相對(duì)定量比較Ct值法計(jì)算各組S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，并根據(jù)各組表達(dá)倍數(shù)差異得出抑制率。

表2RT-PCR引物序列和長(zhǎng)度

Tab.2SequenceandlengthofS100A6-siRNA

GeneSequenceLengthS100A6Forward:5'-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3'Reverse:5'-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3'79bpβ-actinForward:5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3'Reverse:5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'208bp

1.2.5Westernblot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中S100A6蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染步驟同上。轉(zhuǎn)染72h后分別提取各組總蛋白，用BCA蛋白分析試劑測(cè)定蛋白濃度。取30μg總蛋白進(jìn)行100g/LSDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜進(jìn)行免疫印跡，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)S100A6的蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)　　果

2.1siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞用siRNA陰性對(duì)照片段標(biāo)記熒光素FAM摸索轉(zhuǎn)染條件，3組S100A6-siRNA按陰性對(duì)照條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后72h，轉(zhuǎn)染效率>80%(熒光鏡下細(xì)胞數(shù)/光鏡下細(xì)胞數(shù))，轉(zhuǎn)染效果較理想，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

2.2結(jié)腸癌SW480細(xì)胞總RNA的表達(dá)各組轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)28S和18S特征性條帶，證明細(xì)胞總RNA完整性較好，無明顯降解發(fā)生(圖2)。

2.3結(jié)腸癌SW480細(xì)胞S100A6mRNA的表達(dá)采用Real-timePCR法觀察S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達(dá)，β-actin為內(nèi)參,得到擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖3)，熔解曲線為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，無引物二聚體形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

圖1對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞Fig.1ControlplasmidwastransfectedinSW480cells(×400)

A：光鏡下細(xì)胞數(shù)；B：熒光鏡下細(xì)胞數(shù)。

圖2SW480細(xì)胞總RNA的電泳結(jié)果

Fig.2TotalmRNAlevelofSW480cells1. 空白組；2. 對(duì)照組；3.S100A6si-1；4.S100A6si-2；5.S100A6si-3。

圖3擴(kuò)增曲線和熔解曲線

Fig.3Amplificationcurveandmeltcurve

A：擴(kuò)增曲線；B：熔解曲線。

2.4S100A6mRNA的相對(duì)定量結(jié)果采用Real-timePCR中相對(duì)定量比較Ct值法比較目的基因mRNA的相對(duì)含量。結(jié)果顯示，siRNA-S100A6實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；S100A6si的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組相比，S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05)，抑制率達(dá)到87.9%；空白組與陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3、圖4)。提示從mRNA水平上證明了S100A6-siRNA明顯抑制了SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6的表達(dá)。

表3各組間S100A6mRNA的表達(dá)倍數(shù)

Tab.3mRNAexpressionlevelofS100A6-siRNAindifferentgroups

組別ΔCt值△△Ct倍數(shù)(2-△△Ct)空白組6.896±0.0440.000±0.0441.000陰性對(duì)照組6.891±0.0150.036±0.0150.976S100A6si-1組8.935±0.1102.080±0.1100.237S100A6si-2組9.910±0.1173.055±0.1170.121S100A6si-3組7.632±0.0770.777±0.0770.584

圖4S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的mRNA表達(dá)

Fig.4mRNAexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與S100A6si-2比較，#P<0.05。

2.5結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中S100A6蛋白的表達(dá)免疫印跡結(jié)果證明，S100A6siRNA實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，圖5)，S100A6siRNA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，S100A6si-2組與S100A6si-1、S100A6si-3組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05)，抑制率達(dá)到85.0%；空白組與陰性對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示從蛋白水平證明了S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受抑制。

3　討　　論

在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，胃癌的多藥耐藥性與CacyBP/SIP上調(diào)有關(guān)，并且CacyBP/SIP可以調(diào)控胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的應(yīng)答反應(yīng)[11]，首次發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可能是胃癌多藥耐藥治療的潛在靶點(diǎn)。本課題組早期制備了CacyBP/SIP的單克隆抗體[12]。隨后研究了CacyBP/SIP在正常組織及腫瘤組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在正常結(jié)腸黏膜組織不表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)[3]。進(jìn)一步研究了CacyBP/SIP在不同大腸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在大腸增生性息肉中不表達(dá)，在大腸腺瘤組織、大腸癌組織中高表達(dá)。提示CacyBP/SIP可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中亦高表達(dá)[5]。

圖5S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

Fig.5ProteinexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

A：S100A6轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的相對(duì)蛋白表達(dá)量(1：空白組；2：對(duì)照組；3：S100A6si-1；4：S100A6si-2；5：S100A6si-3)。B：不同轉(zhuǎn)染組S100A6/GAPDH的相對(duì)表達(dá)比較，與對(duì)照組比較，*P<0.05；與S100A6si-2比較，#P<0.05。

FILIPEK[14]、WU[15]在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB-2a細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP具有Ca2+依賴的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。本課題組在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，給予胃泌素[4-5]、細(xì)胞外刺激因子如表皮生長(zhǎng)因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激，可以誘導(dǎo)CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞[16]和結(jié)腸癌細(xì)胞[5]中，CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核后可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，使G1期縮短。提示CacyBP/SIP通過核轉(zhuǎn)位參與了細(xì)胞周期調(diào)控。我們進(jìn)一步篩選并驗(yàn)證了結(jié)腸癌核轉(zhuǎn)位后的下游信號(hào)分子[9]。但是CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不明確。

根據(jù)CacyBP/SIP的結(jié)構(gòu)分析，CacyBP/SIP可以和S100蛋白家族、Skp1、tubulin及ERK1/2四個(gè)靶蛋白結(jié)合[17]，而S100蛋白是唯一依賴Ca2+結(jié)合CacyBP/SIP的靶蛋白。因此，S100蛋白可能調(diào)控CacyBP/SIP依賴Ca2+濃度的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。FILIPEK[1]最早在小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞中以S100A6的配體形式發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，給予Ca2+刺激，S100A6可以與CacyBP/SIP結(jié)合。S100A6是分子量為10.5ku的小分子鈣離子結(jié)合蛋白，它可以以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核[18]。S100A6在上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及不同的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，功能研究中發(fā)現(xiàn)S100A6參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和腫瘤形成[19]。綜上提示，S100A6可能是在結(jié)腸癌細(xì)胞中引起CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的靶蛋白。

在本課題中，抑制S100A6與CacyBP/SIP結(jié)合的方法有兩種：①在CacyBP/SIP的S100A6結(jié)合區(qū)構(gòu)建缺失突變體(CacyBP△S1000A6)；②利用siRNA沉默S100A6的表達(dá)。為排除因CacyBP/SIP結(jié)構(gòu)改變而影響其核轉(zhuǎn)位的情況，本研究選擇沉默S100A6構(gòu)建siRNA。RNAi可以被誘導(dǎo)(小于22個(gè)堿基片段的RNA，稱為小干擾RNA，siRNA)載入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，使RNA雙鏈特異性被降解，導(dǎo)致相應(yīng)的基因沉默，是目前用于沉默同源基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的分子技術(shù)。這種由21個(gè)堿基合成的siRNA可以在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)基因沉默，并發(fā)現(xiàn)比長(zhǎng)片段(如shRNA)的沉默效率更高，尤其是將siRNA導(dǎo)入觸發(fā)基因沉默的細(xì)胞中效果更明顯，原因是在Dicer酶表達(dá)量低的細(xì)胞中，shRNA的基因沉默功能會(huì)受到削弱，但是siRNA不會(huì)受到影響。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)人S100A6的mRNA，選擇了3條特異性siRNA靶序列，分別構(gòu)建了3組siRNA轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染S100A6si-2組抑制mRNA和蛋白的表達(dá)效果最好，表明S100A6siRNA構(gòu)建成功。

本研究將S100A6-siRNA轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，從mRNA和蛋白水平鑒定了S100A6-siRNA沉默了S100A6的表達(dá)，為CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供了有利的工具。

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(編輯卓選鵬)

ConstructionandidentificationofS100A6-siRNA

FENGShan-shan1,YANGBo2,LIUAi-qin2,WUJing2,ZHAIHui-hong2

(1.SurgeryLaboratory; 2.DepartmentofDigestiveDiseases,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveToinhibittheexpressionofS100A6proteinwithshortinterferingRNA(siRNA)soastoprovideausefultoolforstudyingcalcyclin(S100A6)-binding-protein(CacyBP)/SIPnucleartranslocationmechanism.MethodsThesiRNAsoftheS100A6codingsequenceweredesignedandtransientlytransfectedtohumancoloncancerSW480cellsbyLipo-fectamine2000.Westernblotandsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)analyseswereusedtoexaminetheexpressionofS100A6inthesetransfectants.ResultsS100A6-siRNAwasconstructedandtransientlytransfectedsuccessfullytohumancoloncancerSW480cellsunderthefluorescencemicroscope.SilentexpressionofS100A6atthemRNAandproteinlevelswasconfirmedbyRT-PCRandWesternblot,respectively(bothP<0.05).TheinhibitoryeffectwasthemostobviousinS100A6si-2group(P<0.05).ConclusionTheavailabletooloftheCacyBP/SIPnucleartranslocationmechanismhasbeenprovidedbyconstructingtheS100A6-siRNA.

coloncancer;S100A6;siRNA;CacyBP/SIP

2016-02-15

2016-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072040)；寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.NZ0897))；寧夏醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.XZ201413)

翟惠虹.E-mail:zhaihuihong@263.net

R57

A

10.7652/jdyxb201605028

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81072040),theNaturalScienceFoundationofNingxia(No.NZ0897),andtheKeyResearchFundsofNingxiaMedicalUniversity(No.XZ201413)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.1016.012.html(2016-08-05)