核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺損導致B細胞抗體產(chǎn)生下降

于　蕊，毛姍姍，梁　偉，孫世杰，王惠國，李文哲

(1. 大連大學生命科學與技術(shù)學院生物學系，遼寧大連　116622；2. 大連醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧大連　116044)

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◇基礎(chǔ)研究◇

核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺損導致B細胞抗體產(chǎn)生下降

于蕊1，毛姍姍2，梁偉2，孫世杰2，王惠國1，李文哲2

(1. 大連大學生命科學與技術(shù)學院生物學系，遼寧大連116622；2. 大連醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧大連116044)

目的探討核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut8)對B細胞抗體產(chǎn)生的影響。方法小鼠經(jīng)OVA免疫后，取其脾臟分離單個淋巴細胞，應用流式細胞術(shù)分析小鼠脾臟細胞中B細胞群的分布情況；ELISPOT實驗檢測小鼠B細胞產(chǎn)生抗體的能力；收集小鼠OVA免疫過程中第0、14、28天的血清，ELISA技術(shù)檢測小鼠血清中抗體的效價。結(jié)果Fut8基因缺失導致小鼠脾臟細胞中所有的B細胞和成熟B細胞的數(shù)量下降(P<0.05)；Fut8-/-小鼠和Fut8+/+小鼠抗體產(chǎn)生細胞的平均數(shù)量分別為16個和27個，與Fut8+/+小鼠相比，F(xiàn)ut8-/-小鼠B細胞產(chǎn)生抗體的能力下降(P<0.05)；第1次免疫之后Fut8-/-和Fut8+/+小鼠抗-OVA IgG抗體的效價分別為1∶12 800和1∶51 200，第2次免疫之后，抗體的效價分別為1∶102 400和1∶409 600，F(xiàn)ut8的缺失導致血清中抗體效價下降(P<0.05)。結(jié)論核心巖藻糖基化對B細胞的抗體產(chǎn)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。

核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut8)；B淋巴細胞；抗體產(chǎn)生

在機體免疫應答的發(fā)生過程中，免疫細胞在受到抗原刺激后會表達和分泌大量免疫分子，發(fā)揮相應的生物學功能。其中成熟B淋巴細胞在抗原刺激下，將增殖分化為漿細胞，分泌相應抗體，介導體液免疫應答。體內(nèi)幾乎所有重要的免疫分子，在結(jié)構(gòu)上都屬于糖蛋白，如免疫球蛋白、細胞因子、補體、粘附分子和MHC分子等[1-2]。這些糖蛋白參與抗原識別和清除、細胞粘附、淋巴細胞活化與凋亡、信號傳遞和內(nèi)吞作用等過程，在免疫應答中發(fā)揮重要作用。

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式，是在各種糖基轉(zhuǎn)移酶催化下完成的。其中，核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α1, 6-fucosyltransferase,Fut8)是催化核心巖藻糖合成的唯一的糖基轉(zhuǎn)移酶，其在高爾基體內(nèi)以GDP-巖藻糖為供體，以α-1，6糖苷鍵的形式把巖藻糖基轉(zhuǎn)移到與天冬酰胺相鄰的N-糖鏈還原末端乙酰葡糖胺，形成核心巖藻糖鏈。研究表明，F(xiàn)ut8基因的缺失會導致一些生長因子受體信號傳導通路異常，能夠顯著降低前B細胞和基質(zhì)細胞之間的粘附作用，使前B細胞的克隆能力明顯下降[3]。Fut8對B細胞功能的影響目前還不是很清楚。本研究將利用Fut8基因敲除鼠(Fut8-/-)探討Fut8對B細胞的發(fā)育及其功能的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料OVA(ovalbumin from Egg White,卵清蛋白)購自上海生工公司；FITC標記的抗-IgM(Ⅱ/41)、抗-CD79b(HM79-16)，PE標記的抗-CD43(S7)、抗-IgD(11-26)，PE-Cy5標記的抗-CD19(MB19-1)，APC標記的抗-CD45R(RA3-6B2)熒光抗體購自e-Bioscience；Anti-mouse IgG2a為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG為江蘇碧云天公司產(chǎn)品；淋巴細胞分離液購自上海生工公司；ELISPOT板、AEC底物均購自深圳達科為公司。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫Fut8-/-小鼠為ICR背景，飼養(yǎng)在大連醫(yī)科大學SPF(specific pathogen-free)實驗動物中心。12周齡的Fut8-/-和Fut8+/+小鼠各3只，經(jīng)腹腔注射OVA抗原(200 μg/只)和弗氏完全佐劑的混合液，2周后第2次免疫，每只直接注射200 μg OVA抗原。每只小鼠分別于免疫第0、14、28天采集外周血，分離血清。本研究符合作者所在單位實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟中B細胞亞群的分布利用血清和抗-CD16/CD32(2.4G2)抗體混合液對脾細胞表面的Fc受體進行封閉，后加入相應熒光標記抗體在冰上孵育15 min，再利用流式細胞儀(BD FACSCalibur)進行分析。

1.2.3ELISPOT實驗檢測小鼠脾臟淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力首先在96孔板包被OVA抗原(50 μg/50 μL)，洗板后30 g/L脫脂奶粉封閉1 h，洗板后每孔加入免疫小鼠脾臟單個淋巴細胞懸液(5×105細胞)，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)16～20 h。洗板后每孔加入1∶5 000稀釋的HRP-標記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育1 h后，AEC顯色。結(jié)果分析由德國艾迪(AID)公司進行。

1.2.4ELISA法檢測小鼠血清中抗體的效價首先在96孔板包被OVA抗原(5 μg/50 μL)，洗板后30 g/L脫脂奶粉封閉1 h，洗板后加入1∶100～1∶204，800倍比稀釋的免疫0、14、28 d的小鼠血清，孵育2 h，洗板后加1∶8 000比例稀釋的HRP-標記的山羊抗小鼠IgG二抗，洗板后加含有H2O2的OPD底物，37 ℃顯色15 min，492 nm測吸光度值。當吸光度值降到0.2(此值根據(jù)未免疫血清的吸光度值定)時所對應的稀釋倍數(shù)代表抗體的效價。

2　結(jié)　　果

2.1Fut8基因的缺失影響了B淋巴細胞的數(shù)量用流式細胞術(shù)分析比較了經(jīng)OVA免疫之后的Fut8+/+小鼠和Fut8-/-小鼠脾臟細胞的類型。結(jié)果顯示，F(xiàn)ut8+/+小鼠和Fut8-/-小鼠脾臟中CD45R+CD19+細胞群(所有B細胞)所占的比例分別為30.6%和17.8%(圖1A、1D)，IgM+IgD+細胞群(成熟B細胞)所占比例分別為7.2%和3.8%(圖1B、1D)，F(xiàn)ut8-/-小鼠脾臟中所有B細胞和成熟B細胞數(shù)量減少(P<0.05)；CD11b+紅細胞群所占的比例分別為5.3%和8.1%(圖1C、1D)，F(xiàn)ut8-/-小鼠紅細胞數(shù)量增多(P<0.05)；而CD5+細胞群所占比例分別為4.3%和3.7%(圖1C、1D)。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ut8基因的缺失影響了B淋巴細胞的分化和發(fā)育。

2.2Fut8基因的缺失導致淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力降低為了進一步研究Fut8對B細胞功能的影響，F(xiàn)ut8+/+和Fut8-/-小鼠(n=3)經(jīng)OVA第2次免疫后14 d，取脾臟分離單個淋巴細胞，進行ELISPOT實驗。結(jié)果顯示，F(xiàn)ut8+/+小鼠和Fut8-/-小鼠脾臟中抗體產(chǎn)生細胞的平均數(shù)量分別為27個和16個(圖2A)。圖2B中每個斑點代表1個分泌抗-OVA IgG抗體的脾臟淋巴細胞，在每孔細胞數(shù)量相同的情況下，產(chǎn)生的斑點數(shù)越多，則表明脾臟淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力越強。上述結(jié)果表明，F(xiàn)ut8基因的缺失影響了B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力。

圖1流式細胞儀分析Fut8-/-小鼠脾臟中B細胞亞群所占的比例

Fig.1 FACS analysis of the proportion of B cells population inFut8-/-SPLs

P<0.05。

圖2Fut8基因的缺失導致淋巴細胞產(chǎn)生抗體的能力下降

Fig.2 The ability of lymphocytes to produce antibodies was decreased by absence ofFut8A：ELISPOT檢測脾臟中抗體產(chǎn)生細胞的平均數(shù)量，P<0.05；B：Fut8+/+和Fut8-/-小鼠脾臟淋巴細胞ELISPOT顯色結(jié)果。

2.3Fut8-/-小鼠血清中抗體的效價在之前的實驗中我們就發(fā)現(xiàn)，免疫之前Fut8-/-小鼠與Fut8+/+小鼠血清中免疫球蛋白的含量相近。為了進一步研究Fut8對抗體產(chǎn)生的影響，我們用OVA(200 μg/只)免疫Fut8+/+和Fut8-/-小鼠(n=3)，分別收集每只小鼠免疫0、14、28 d的血清，應用ELISA方法檢測抗體效價。結(jié)果顯示，第1次免疫之后(14 d)Fut8-/-和Fut8+/+小鼠抗-OVA IgG抗體效價的平均值分別為1∶12 800和1∶51 200，第2次免疫之后(28 d)抗體效價的平均值分別為1∶102 400和1∶409 600(圖3)。以上結(jié)果表明Fut8基因的缺失影響了抗體的產(chǎn)生。

圖3ELISA檢測血清中抗體效價

Fig.3 The serum antibody titer detected by ELISAP<0.05。

3　討　　論

幾乎所有的免疫分子都是糖蛋白，N-多糖修飾參與免疫分子的折疊、穩(wěn)定性和生物功能等。IgG分子的N-多糖修飾與分子的結(jié)合、活性和結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)[4]。在哺乳動物的N-多糖修飾中，核心巖藻糖基化修飾是比較普遍的翻譯后修飾過程。大量證據(jù)證明，膜受體的核心巖藻糖基化修飾與配體的親和力、低聚化和生物功能等密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ut8在BCR的抗原識別、B細胞活化和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5]。

B細胞的活化是一個嚴格的抗原致敏的過程，依賴于BCR與配體的親和力，BCR不是由抗原刺激產(chǎn)生的，而是B細胞發(fā)育過程中存在于細胞膜表面的球蛋白，BCR介導的信號被認為是B細胞活化的第一信號。UBELHART等[6]發(fā)現(xiàn)，前BCR重鏈具有5個N-糖基化位點，BCR N46位糖鏈缺失導致BCR重鏈與輕鏈的組合及細胞信號傳導受阻。最新研究表明，糖基化修飾對BCR的功能具有重要的影響，如糖基化在維系BCR立體構(gòu)象和水溶解性中起著至關(guān)重要作用，如糖基化程度減少，會使BCR肽鏈缺乏韌性；糖基化過度，會遮住BCR的抗原結(jié)合位點，影響與抗原的結(jié)合[7]。質(zhì)譜分析表明IgG分子含有核心巖藻糖基[8]。因此，核心巖藻糖基化修飾缺失可能會影響B(tài)CR與抗原的識別，導致B細胞信號轉(zhuǎn)導異常，抗體產(chǎn)生能力下降。

Fut8通過修飾蛋白質(zhì)的核心巖藻糖基化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子間相互作用、細胞間的識別、膜蛋白的表達、細胞信號傳導和增殖[1,7]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白是富含核心巖藻糖基化的糖蛋白。慢性關(guān)節(jié)炎患者的IgG重鏈的核心巖藻糖明顯高于正常人，說明核心巖藻糖基化對于IgG的生物活性發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。另外，糖基化對于維持B細胞mIgM的立體結(jié)構(gòu)也非常重要。糖基化程度低，mIgM肽鏈缺乏剛性[10]。在我們應用Fut8-/-小鼠脾細胞和細胞模型進行ELISPOT實驗時，由于B細胞mIgM核心巖藻糖基化異常，可能影響了其與抗原的相互結(jié)合，導致活化信號傳導出現(xiàn)問題。同時，F(xiàn)ut8基因的缺失也會影響抗體產(chǎn)生所必需的某些轉(zhuǎn)錄因子的功能，致使抗體產(chǎn)生和分泌能力下降(圖2、圖3)。

免疫球蛋白是高度核心巖藻糖基化的糖蛋白，如果缺失核心巖藻糖基化能夠增加Fc與Fc受體的親和力，進而增強由NK細胞介導的ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxity)效應近50～100倍[11]。但是，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化的缺失影響IgG BCR識別抗原進而影響抗原特異性抗體的產(chǎn)生。另外，抗體分子的N-糖鏈也影響血清中的抗體的半衰期[12]。由此可見，蛋白質(zhì)糖基化，特別是核心巖藻糖基化與抗體的生物學功能具有密切聯(lián)系。Fut8基因的缺失使抗體產(chǎn)生所必需的轉(zhuǎn)錄因子的表達量下調(diào)，進而影響了抗體的產(chǎn)生[13-14]。本實驗通過Fut8基因敲除小鼠模型證實了核心巖藻糖修飾對B細胞抗體產(chǎn)生具有重要的調(diào)節(jié)作用，為蛋白質(zhì)糖基化與免疫異常相關(guān)疾病的研究提供了新的思路。

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(編輯卓選鵬)

Core fucosyltransferase reduces Ab production of B cells

YU Rui1, MAO Shan-shan2, LIANG Wei2, SUN Shi-jie2, WANG Hui-guo1, LI Wen-zhe2

(1. Department of Biology, College of Life Science and Technology of Dalian University,Dalian 116622; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology,College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

ObjectiveTo explore the role of core fucosyltransferase (Fut8) on Ab production. MethodsSPL lymphocytes were isolated from OVA-immunized mice. Population of B cells was analyzed by flow cytometry. The frequency of Ab secreting cells was detected by enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT).Fut8+/+andFut8-/-mice were immunized with OVA, and the immune sera were collected at 0, 14 and 28 d. The Ab titers were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). ResultsWe found that lack ofFut8 gene impaired B cell generation in the spleen after OVA immunization. The number of IgG-producing cells ofFut8-/-andFut8+/+SPLs was 16 and 27, respectively. Compared with that ofFut8+/+SPLs, the frequency of IgG-producing cells was significantly reduced inFut8-/-SPLs (P<0.05). ELISA analysis showed that the titers of anti-OVA IgG in the immune sera ofFut8-/-andFut8+/+mice were 1∶12 800 and 1∶51 200, respectively; after the first immunization (14 d) and the boost immunization (28 d), they reached 1∶102 400 and 1∶409 600, respectively. These results suggested that the disruption ofFut8 led to reduction in Ab production (P<0.05). ConclusionThese results show that core fucosylation modified byFut8 plays an important role in the regulation of Ab production.

core fucosyltransferase (Fut8); B lymphocyte cell; Ab production

2015-11-09

2016-05-01

國家自然科學基金資助項目(No.31270864，30972675)

李文哲. E-mail: liwenzhe46@hotmail.com；王惠國. E-mail: wanghuiguo163@163.com

R392.11

A

10.7652/jdyxb201605003

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31270864 and 30972675)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160802.1144.006.html(2016-08-02)