槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

徐志遠(yuǎn)　程向東　杜義安　呂航　張?jiān)X　陳佳輝

槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

徐志遠(yuǎn)程向東★杜義安呂航張?jiān)X陳佳輝

目的 研究槐耳浸膏對胃癌耐藥細(xì)胞（SGC7901/Fu）耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法 CCK-8法計算SGC7901/Fu細(xì)胞的耐藥性；光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變；realtime RT-PCR法檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)；Western-blot法檢測snail及Zeb2蛋白的表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡觀察E-cadherin的表達(dá)及分布。結(jié)果 0.1～ 0.5 mg/ml濃度范圍內(nèi)，槐耳浸膏能增加SGC-7901/FU細(xì)胞對5-Fu、DDP的敏感性；槐耳浸膏作用后SGC7901/Fu呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)改變，伴上皮表型標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)表型標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，侵襲能力增強(qiáng)。結(jié)論 槐耳浸膏能部分逆轉(zhuǎn)SGC-7901/Fu細(xì)胞的耐藥性，其機(jī)制可能是通過調(diào)控EMT而實(shí)現(xiàn)的。

胃癌 化療耐藥 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 槐耳

我國是胃癌高發(fā)地區(qū)之一，且中晚期胃癌（進(jìn)展期胃癌）占較大的比例，化療是胃癌綜合治療的主要手段之一，然而目前化療總體有效率較低，其中多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）是制約胃癌化療療效的關(guān)鍵。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）與MDR的關(guān)系是目前腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。前期研究發(fā)現(xiàn)槐耳浸膏能顯著增加胃癌細(xì)胞對化療的敏感性［1］，然而其作用機(jī)制尚不明確。為此，本課題用槐耳浸膏作用于體外培養(yǎng)的人胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/Fu，觀察其EMT的變化，初步探討槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，SGC-7901/Fu為SGC7901的多耐藥細(xì)胞株，用5-Fu逐步誘導(dǎo)其耐藥性，由浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所誘導(dǎo)產(chǎn)生并長期保存；細(xì)胞RNA提取用Trizol（購自美國Ambion公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Real time試劑盒（購自日本TaKaRa公司）；蛋白提取用RIPA（購自上海碧云天公司）；兔抗人E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）抗體（購自美國Epitomics公司）；兔抗人波形蛋白（vimentin）、snail、Zeb1、Zeb2、twist抗體（購自英國Abcam公司）；兔抗人β-catenin單克隆抗體（購自美國cell signaling technology公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（購自日本東仁化學(xué)公司）；槐耳浸膏（啟東蓋天力藥業(yè)有限公司），將2g槐耳浸膏溶于20ml完全培養(yǎng)基中，用0.22μm微孔濾膜過濾后得到100mg/ml儲備液，于-20℃長期儲存，臨用前解凍，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2方法 （1）細(xì)胞株與培養(yǎng)：SGC7901、SGC-7901/Fu細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPM1640中，置于37℃、含有5%CO2溫箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。（2）中效濃度（IC50）計算：采用細(xì)胞增殖試劑盒CCK-8計算中效濃度。將SGC7901、SGC7901/Fu細(xì)胞均按1×104個/孔，接種于96孔培養(yǎng)板中，24h后更換培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，更換正常培養(yǎng)基（100μl/孔）并繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加入CCK-8（10μl/孔），并設(shè)置若干空白調(diào)零孔，將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～2h后取出，用酶標(biāo)儀于450nm處檢測各孔吸光度值（OD值），并按公式計算中效濃度［2］，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（3）細(xì)胞侵襲試驗(yàn)（transwell試驗(yàn)）：配制1：9稀釋Matrigel膠，充分混勻后按每小室30μl鋪膠至transwell小室內(nèi)部的膜上，置37℃培育0.5h；將細(xì)胞吹散成單細(xì)胞懸液，取5×104個細(xì)胞，稀釋至終體積200μl，加入Transwell小室的上室；下室加入600μl含20%血清的培養(yǎng)基，去除氣泡后，常規(guī)培養(yǎng)48h，取出小室，甲醇固定25min，結(jié)晶紫染色30min，自來水沖洗后用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，將聚碳酸酯膜切下后貼在干凈載玻片上，封片后細(xì)胞計數(shù)：隨機(jī)選取5個視野（400×）計數(shù)細(xì)胞個數(shù)，取均數(shù)。（4）實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime RT-PCR）檢測mRNA表達(dá)：用Trizol提取細(xì)胞的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green染料法進(jìn)行realtime RT-PCR反應(yīng)，在384孔PCR反應(yīng)板中按說明書依次加入各個組份，制成10μl的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件參考試劑說明。每次檢測設(shè)立3個復(fù)孔，重復(fù)≥3次。運(yùn)用2-△△Ct方法確定目的基因表達(dá)的相對水平。引物由上海生工設(shè)計合成，引物序列見文獻(xiàn)［3］。（5）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白的表達(dá)水平：分別將細(xì)胞懸于RIPA細(xì)胞裂解液，吹打均勻并室溫劇烈振蕩破碎40min，間隙冰浴。收集裂解液經(jīng)20，000×g、4℃離心15min，取上清液。蛋白定量后分裝，-70℃貯存?zhèn)溆?。按照?biāo)準(zhǔn)方法測定細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，一抗稀釋倍數(shù)參考抗體說明書。（6）激光共聚焦檢測E-cadherin的表達(dá)和分布：前一天接種細(xì)胞至NEST小皿中，約（1～10）×105/皿，培養(yǎng)過夜；用4%多聚甲醛室溫固定30min；0.1%～0.2%的triton X-100（用PBS配制，使用前現(xiàn)配）500μl/皿，破膜10min；用5% BSA 500μl/皿，封閉1h；根據(jù)說明書加入抗體，300μl/皿，放入4℃冰箱過夜；用1：1000的RNase 300μl/皿，作用20min；加入二抗300μl/皿，避光反應(yīng)1h；用PBS洗3次（5min/次）后上機(jī)檢測。

2　結(jié)果

2.1SGC-7901/Fu細(xì)胞的耐藥性 在0.1～ 0.5 mg/ml濃度范圍內(nèi)槐耳浸膏與5-Fu、DDP聯(lián)合用藥時，可使SGC-7901/Fu細(xì)胞對5-Fu、DDP的IC50均明顯下降（P＜0.05），對5-Fu和DDP的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.23倍、1.31倍、 1.74倍、2.07倍、1.95倍和1.21倍、1.26倍、1.63倍、1. 35倍、1. 87倍，見表1。

表1　槐耳浸膏對SGC-7901/Fu耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.2槐耳浸膏對細(xì)胞形態(tài)的影響 SGC7901細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小均一，鋪路石樣或多邊形，細(xì)胞間結(jié)合緊密（Fig 2A）；SGC7901/Fu細(xì)胞呈梭形生長為主，不規(guī)則，細(xì)胞體積略增大（Fig 2B）；經(jīng)0.5mg/ml槐耳浸膏處理24h后，部分細(xì)胞SGC7901/Fu細(xì)胞細(xì)胞極性恢復(fù)，細(xì)胞間結(jié)合緊密（Fig 2C），提示SGC7901/Fu細(xì)胞發(fā)生了EMT，而槐耳浸膏能部分逆轉(zhuǎn)該過程，見圖1。

2.3槐耳浸膏對EMT標(biāo)記物表達(dá)的影響 Realtime RT-PCR的方法檢測了EMT相關(guān)標(biāo)記物及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示槐耳浸膏組上皮表型標(biāo)記物如E-cadherin、claudin-1的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而間質(zhì)表型標(biāo)記物如Vimentin、β-catenin、Snail、Zeb2的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），N-cadherin、twist、slug的表達(dá)無明顯差異，見圖2。

圖1　槐耳浸膏對SGC7901/Fu細(xì)胞形態(tài)的影響。A：SGC7901的細(xì)胞形態(tài)；B：SGC7901/Fu的細(xì)胞形態(tài)；C：槐耳浸膏作用后SGC7901/Fu的細(xì)胞形態(tài)

2.4槐耳浸膏對snail、Zeb2、E-cadherin表達(dá)的影響 進(jìn)一步應(yīng)用Western blot的方法檢測槐耳浸膏對SGC-7901/Fu細(xì)胞Snail及Zeb2表達(dá)的影響，結(jié)果顯示槐耳浸膏能顯著降低SGC-7901/Fu細(xì)胞Snail及Zeb2的表達(dá)（圖3A）。激光共聚焦顯微鏡檢測提示槐耳浸膏組中E-cadherin的表達(dá)明顯升高（圖3B）。

圖2　槐耳浸膏對SGC7901/Fu細(xì)胞EMT相關(guān)基因的表達(dá)的影響

圖3　槐耳浸膏對Snail、Zeb2、E-cadherin表達(dá)的影響

3　討論

近年來，從植物中提取的各種活性物質(zhì)以其有效低毒的優(yōu)勢作為腫瘤治療和疾病預(yù)防的替代物日益得到人們的重視，許多草藥及天然產(chǎn)物在我國正應(yīng)用于腫瘤治療的臨床實(shí)驗(yàn)中，對其作用機(jī)理的研究報道也日益增多?；倍酁榛倍婢臒崴崛∥铮哂休^好的抗腫瘤效果。本課題組前期研究已證明槐耳浸膏能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并增加其對順鉑等化療藥物的敏感性［1］，但其在逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥中的作用尚不明確。本研究旨在進(jìn)一步研究槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/Fu耐藥性的機(jī)制。

EMT與化療耐藥的關(guān)系是目前腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一［3］。EMT指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。EMT已被證實(shí)參與了人體許多生理、病理過程，而越來越多的研究表明EMT也是腫瘤耐藥形成的重要原因，Harada K等［4］用5-Fu處理一系列口腔上皮癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)殘余癌細(xì)胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象。前期研究也提示EMT是胃癌細(xì)胞獲得化療耐藥的重要機(jī)制之一［5］。本課題通過細(xì)胞形態(tài)觀察進(jìn)一步證實(shí)胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/Fu發(fā)生了EMT，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變梭形、細(xì)胞極性消失，而槐耳浸膏能使SGC-7901/Fu細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞極性，說明槐耳浸膏能部分逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的EMT。

細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平的改變是EMT的重要標(biāo)記。發(fā)生EMT后上皮表型標(biāo)記物如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、ZO-1、claudin-1等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)表型標(biāo)記物如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等表達(dá)升高［6］，本研究提示槐耳浸膏作用于SGC-7901/Fu細(xì)胞后上皮表型標(biāo)記物如E-cadherin、 claudin-1的表達(dá)明顯升高，而間質(zhì)表型標(biāo)記物如Vimetin、β-catenin等表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步證實(shí)槐耳浸膏能逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的EMT。

各種病理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT的機(jī)制幾乎都是與調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)［7］，這些轉(zhuǎn)錄因子包括snail、slug、twist1、twist2、Zeb1、Zeb2、Foxc1、Foxc2、FoxA1及Goosecoid等，其能直接調(diào)控上皮或間質(zhì)表型標(biāo)記物的表達(dá)。本項(xiàng)目通過realtime RT-PCR的方法檢測了snail、slug、twist、Zeb2及Zeb2等的表達(dá)變化，結(jié)果提示槐耳浸膏能顯著降低SGC-7901/Fu細(xì)胞中Snail及Zeb2的基因表達(dá)水平，Western-blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果，說明槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)SGC-7901/Fu細(xì)胞EMT可能是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail及Zeb2的基因而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，槐耳浸膏能顯著升高胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/Fu中上皮表型標(biāo)記物E-cadherin、claudin-1的表達(dá)，降低間質(zhì)表型標(biāo)記物Vimetin、β-catenin及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Zeb2等的表達(dá)，提示槐耳浸膏逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥可能是通過調(diào)控其EMT而實(shí)現(xiàn)的。

［1］汪麗菁，謝華夏，徐志遠(yuǎn)，等.槐耳浸膏增加人胃腺癌細(xì)胞MKN45對順鉑敏感性研究.中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（3）：868-871.

［2］徐志遠(yuǎn)，戴朝六，王寧.塞來昔布對人肝癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響.腫瘤學(xué)雜志， 2008， 14（11）： 902-905.

［3］Iwatsuki M， Mimori K， Yokobori T， et al. epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance. Cancer Sci， 2010，101（2）：293-399.

［4］Harada K， Ferdous T， Ueyama Y， et al. Establishment of 5-fluorouracil-resistant oral squamous cell carcinoma cell lines with epithelial to mesenchymal transition changes. Int J Oncol，2014， 44（4）：1302-1308.

［5］徐志遠(yuǎn)，程向東，杜義安，等. 化療后殘余胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外研究. 中國腫瘤臨床，2013，40（18）：1085-1088.

［6］Natarajan J， Chandrashekar C， Radhakrishnan R. Critical biomarkers of epithelial-mesenchymal transition in the head and neck cancers. J Cancer Res Ther，2014， 10（3）：512-518.

［7］Lamouille S， Xu J， Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（3）： 178，196.

Objective To investigate the huaier's role in reversing chemoresistance and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of chemoresistant gastric cancer cells（SGC7901/Fu）. Methods CCK-8 method was used to determinate the reversal role of Huaier on the chemoresistance of SGC7901/Fu cells； the realtime RT-PCR was used to determine the expression level of EMT markers and EMT-related transcriptional factors；Western-blot was used to determine the protein level of snail and Zeb2； Confocal microscopy analysis was used to determine the change of expression and distribution of E-cadherin；Transwell analysis was used to the change of invasion ability. Results The combined used of Huaier，at 0.1～ 0.5 mg/ ml concentration，and DDP or 5-Fu could increase the chemo-sensitivity of SGC7901/Fu cells to DDP and 5-Fu；The use of Huaier on SGC7901/ Fu cells resulted in mesenchymal appearance，decreased expression of epithelial markers and increased expression of mesenchymal markers. Conclusion Huaier could partly reverse the chemoresistance of SGC7901/Fu cells，the underline mechanism might include regulating EMT process.

Gastric cancer Chemoresistance Epithelial-mesenchymal transition Huaier

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)研究計劃（2012ZZ002）；浙江省

中醫(yī)藥管理局一般項(xiàng)目（2013ZA022，2015ZA090）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科

（徐志遠(yuǎn) 程向東 呂航 張?jiān)X 陳佳輝）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤外科（杜義安）