不同濃度CB2受體激動劑預(yù)處理對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

馮婭妮,石　強(qiáng)

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不同濃度CB2受體激動劑預(yù)處理對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

馮婭妮a,石強(qiáng)b*

目的探討CB2受體激動劑AM1241預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。方法離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分成6組：對照組(Con組)，細(xì)胞未做特殊處理。CoCl2組：300 μM CoCl2預(yù)處理4 h后，正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。AM1241 1 μmol/L組、AM1241 3 μmol/L組、AM1241 5 μmol/L組、AM1241 10 μmol/L組：培養(yǎng)孔中分別加入濃度為1、3、5、10 μM AM1241處理2 h后，加入300 μM的CoCl2處理4 h，然后更換正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后更換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。MTT法測定細(xì)胞增殖，RT-PCR技術(shù)檢測bcl-2、caspase-3、iNOS mRNA的表達(dá)。結(jié)果與AM1241 1 μmol/L組和AM1241 3 μmol/L比較，AM1241 5 μmol/L組和AM1241 10 μmol/L組預(yù)處理明顯增加海馬神經(jīng)元的增殖能力(P<0.05或P<0.01),上調(diào)bcl-2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因caspase-3和iNOS mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論5 μM和10 μM AM1241預(yù)處理通過對凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，對缺氧/復(fù)氧后的海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。

CB2受體；細(xì)胞凋亡；海馬；神經(jīng)元

0　引言

凋亡是腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)典的死亡方式[1-2]。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)通過抗氧化抑制自由基的形成，抑制鈣內(nèi)流，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育等對神經(jīng)元起保護(hù)作用[3-4]。在腦外傷及腦缺血缺氧的模型中顯示出大麻素的保護(hù)作用，但確切機(jī)制目前尚不完全清楚[5]。本研究擬觀察不同濃度的CB2受體激動劑AM1241預(yù)處理后對大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1海馬細(xì)胞的制備新生24 h的SD大鼠(由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供)，無菌剝離大鼠全腦后，顯微鏡下分離雙側(cè)海馬組織。將海馬組織塊移入0.125%胰蛋白酶(Sigma公司，美國)的解剖液中，37 ℃消化30 min。以(4～5)×108個/min的密度將神經(jīng)元接種在50 mL的無菌培養(yǎng)瓶中(Coster公司，美國)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)9 d，傳代密度為0.2×108個/L。

1.2分組及處理隨機(jī)分成6組：對照組(Con組)細(xì)胞不做特殊處理，CoCl2組：用300 μmol/L CoCl2處理4 h，用正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后更換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。AM1241/1組、AM1241/3組、AM1241/5組、AM1241/10組：培養(yǎng)孔中分別加入濃度為1、3、5、10 μmol/L AM1241(此濃度由預(yù)實驗獲得)處理2 h后，加入300 μmol/L的CoCl2處理4 h，然后更換正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后更換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),再測定有關(guān)指標(biāo)。

1.3MTT法測AM1241對海馬神經(jīng)細(xì)胞活力的影響每組36孔，每孔加0.25%MTT溶液20 μL，37 ℃、5% CO2孵育4 h，將上清去掉，每孔加入10%的二甲亞砜(DMSO)100 μL，用雙波長掃描分光光度計測定標(biāo)本，在490 nm處測光吸收值(OD值)以判斷細(xì)胞活力。

1.4RT-PCR檢測bcl-2、caspase-3、iNOS的轉(zhuǎn)錄采用Trizol法提取各組神經(jīng)元的RNA，分別在預(yù)處理后24 h收集細(xì)胞提取RNA，Real-time PCR引物委托TaKaRa公司合成。反轉(zhuǎn)錄過程中利用隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物,將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)對照。bcl-2引物片段長度為402 bp,上游：5′-GTCATGTGCATTTCCACGTC-3′，下游：5′-ACAAACCCCCCACACAGCAAAG-3′；caspase-3引物片段長度為363 bp,上游：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC3,下游：5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3’；iNOS引物片段長度為499 bp,上游：5-′CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3’；下游：CTGAGGGCTCTGTTGAGGTC-3’；GAPDH引物片段長度為338 bp,上游:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。取1.5%瓊脂糖凝膠擴(kuò)增，用KODAKID型凝膠成像，使用該公司的quantityOne圖像軟件對電泳條帶進(jìn)行分析,以各目的帶與內(nèi)參對照的比值表示mRNA的表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1海馬細(xì)胞活力的變化經(jīng)過5、10 μmol/L AM1241預(yù)處理后，在無血清培養(yǎng)條件下，海馬細(xì)胞的增殖高于無預(yù)處理組(P<0.01)。見表1。

2.2bcl-2、caspase-3和iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄的變化與AM1241/1組和AM1241/3組比較，AM1241/5和AM1241/10組預(yù)處理明顯上調(diào)bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.01或P<0.05)，下調(diào)caspase-3 mRNA和iNOS mRNA的表達(dá)(P<0.05)。見表2。

表1　各組OD值的變化

注：與Con組比較，**P<0.01；與CoCl2組比較，##P<0.01

表2　各組bcl-2、iNOS、caspase-3 mRNA表達(dá)變化

注：與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與CoCl2組比較，#P<0.05

3　討論

大麻素受體分為中樞型大麻受體(CB1)和外周型大麻受體(CB2)，在生理狀態(tài)下，CB2在中樞系統(tǒng)中的含量很低，但當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時，大量的CB2受體表達(dá)增加，凋亡減少。其可能通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性因子，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，從而減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)[6]。本研究通過建立細(xì)胞缺血模型，進(jìn)一步研究大麻素系統(tǒng)對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用及機(jī)制。

研究神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧的模型常用動物模型，本研究用CoCl2模擬神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞水平的缺氧刺激，建立了一種簡便細(xì)胞缺氧模型。CoCl2可以誘導(dǎo)低氧過程的關(guān)鍵因子低氧誘導(dǎo)因子1-α的上調(diào)，從而調(diào)節(jié)低氧的諸多效應(yīng)基因的表達(dá)變化，是比較公認(rèn)的化學(xué)乏氧的模擬物[7]，我們在實驗中用300 μM CoCl2預(yù)處理海馬神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元的增殖能力下降，凋亡水平升高。

神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧過程包括：Ca2+超載、炎性反應(yīng)、自由基生成增加等因素，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。研究表明，內(nèi)源性大麻素類物質(zhì)具有中樞保護(hù)作用，主要與其抗凋亡，減輕炎癥反應(yīng)造成的繼發(fā)性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，調(diào)節(jié)多種類型神經(jīng)細(xì)胞的死亡與存活，抑制誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)。提示AM1241通過作用于神經(jīng)損傷的多個環(huán)節(jié)，從而抑制細(xì)胞凋亡。

Bcl-2是B淋巴瘤-2基因(bcl-2)家族中重要的抗細(xì)胞凋亡基因，其功能與抑制細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞生存有關(guān)[9-10]。本研究結(jié)果表明,海馬細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷后,bcl-2表達(dá)明顯減少，5、10 μmol/L AM1241預(yù)處理可顯著增加bcl-2的表達(dá),可見，AM1241是通過調(diào)節(jié)海馬細(xì)胞bcl-2基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗損傷作用。 在缺氧的調(diào)節(jié)下，iNOS被激活并產(chǎn)生NO，后者是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要因素。內(nèi)源性大麻素可以通過抑制多種信號通路的轉(zhuǎn)錄來抑制iNOS的生成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素通過減少神經(jīng)元產(chǎn)生的炎癥因子，減輕炎癥反應(yīng)造成的繼發(fā)性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，5、10 μmol/L AM1241預(yù)處理可以明顯提高海馬神經(jīng)元的增殖能力，并減少iNOS mRNA的表達(dá)。表明iNOS在AM1241預(yù)處理神經(jīng)元的保護(hù)作用起到了重要作用。

綜上所述，用一定濃度的AM1241預(yù)處理對大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損失有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與增加bcl-2的表達(dá)，減少凋亡基因caspase-3和iNOS mRNA的表達(dá)相關(guān)。然而，AM1241對神經(jīng)元的保護(hù)作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步證實。

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Neuroprotection of CB2 agonist preconditioning of different concentration on rat hippocampal neurons apoptosis and its mechanism

FENG Ya-nia,SHI Qiangb*

(a.Department of Anesthesiology,b.Department of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shengyang 110001,China)

ObjectiveTo determine the effects of CB2 agonist AM1241 preconditioning on rat hippocampal neurons apoptosis induced by anoxia-reoxygenation.MethodsHippocampal neurons were cultured and randomly assigned to six groups:control group;CoCl2group,in which cells were treated with 300 μM CoCl2(chemical anoxia analogue) for 4 h,cultured with normal medium for 24 h,and then stimulated with out serum media;AM1241 1 μmol/L,AM1241 3 μmol/L,AM1241 5 μmol/L and AM1241 10 μmol/L group:the neurons were pretreated with 1,3,5,and 10 μM AM1241,then 300 μM CoCl2were added after 2 h，then the others were the same as CoCl2group. MTT method was used to detect the proliferation of neurons.Then RT-PCR method was used to determine the expression of bcl-2,caspase-3,iNOS mRNA.ResultsCompared with AM1241 1 μmol/L and AM1241 3 μmol/L group,when pretreated with 5 μM and 10 μM AM1241,cell proliferation increased (P<0.05 orP<0.01).The bcl-2 mRNA was up-regulated,and caspase-3 and iNOS mRNA were down-regulated (P<0.05 orP<0.01).ConclusionPreconditioning with 5 μM and 10 μM AM1241 can protect hippocampal neurons against anoxia-reoxygenation injury by attenuating apoptosis.

CB2 receptor;Cell apoptosis;Hippocampus;Neurons

2015-08-12

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.麻醉科，b.神經(jīng)外科,沈陽110001

遼寧省教育廳科學(xué)研究項目(L2014293)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609003