水稻抗氧化酶活性對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答及其對(duì)Cd吸收的影響

王娟娟

摘 要：該文首先研究了4個(gè)水稻品種的Cd吸收積累狀況，并對(duì)水稻的Cd積累類型作出區(qū)分，之后對(duì)水稻體內(nèi)各抗氧化酶與水稻Cd吸收的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，GR活性與莖葉Cd含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），且GR在低積累型水稻體內(nèi)的活性顯著高于高積累型（P<0.05），APX的研究結(jié)果則和GR相反。這表明，GR活性的提高對(duì)減少Cd吸收也起到積極的作用，APX則起到消極作用。

關(guān)鍵詞：水稻；鎘；抗氧化酶；積累

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）16-0021-04

Abstract：In present studies，Cd uptake and distribution of 4 rice cultivars have been studies by a pot trial（added with 10mg Cdkg-1）and a hydroponic experiment under 4 Cd levels（0、25、50 and 100μM）. Then，the responses of the antioxidant enzyme of rice under Cd stress，and the relationship between activities of antioxidant enzyme and rice Cd uptake have been also explored by a hydroponic culture.The results showed that there were significant differences in activities of glutathione reductase（GR）and ascorbic acid peroxidase（APX）among 4 rice cultivars，especially between W2168 and RBQ. The activities of GR in RBQ were higher than in W2168，APX were opposite. In addition，significant positive correlation existed between Cd concentrations and APX activities in shoot（P < 0.05）. Activities of GR were negatively related to Cd concentrations in shoot（P < 0.05）.These results indicated that，the improvement of the activities of GR may reduce the rice Cd uptake. APX were opposite.

Key words：Rice；Cd；Antioxidant Enzyme；Accumulate

隨著農(nóng)田Cd污染狀況的加劇，土壤中Cd含量的增加，已經(jīng)嚴(yán)重影響到了土壤的環(huán)境質(zhì)量，并且?guī)砹艘幌盗袊?yán)重的環(huán)境問題[1]。因Cd污染帶來的糧食作物食品安全問題也越來越嚴(yán)重，因此，減少和控制水稻Cd積累，已經(jīng)成為治理Cd污染的主要問題[2]。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)和生物修復(fù)方法，因成本高、修復(fù)周期長(zhǎng)等原因，無法大面積應(yīng)用，因此，從現(xiàn)有的水稻品種中篩選或挖掘植物自身潛力并借助基因工程手段培育出對(duì)重金屬高耐性、低積累的水稻品種，在目前被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的解決途徑。

在對(duì)各種逆境的不斷適應(yīng)過程中，生物體進(jìn)化形成了完善且復(fù)雜的由酶類和非酶類物質(zhì)組成的抗氧化系統(tǒng)來清除活性氧。研究表明，酶類物質(zhì)可以使體內(nèi)的活性氧自由基變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，從而削弱它們對(duì)植物體的傷害[3]?？寡趸到y(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，使生物體內(nèi)活性氧維持在較低水平[4]，從而使植物可以進(jìn)行正常的生長(zhǎng)和代謝。大量研究表明[5-6]，抗氧化酶活性的提高能減輕重金屬對(duì)植物造成的氧化傷害。因此，抗氧化系統(tǒng)對(duì)植物的重金屬抗性的提高有著重要意義。有研究表明，組成抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)酶對(duì)活性氧、自由基的防御能力是決定植物逆境抗性的重要因素[7]。

對(duì)農(nóng)作物而言，提高其重金屬抗性并不是最終的目的，而獲得高耐性﹑低積累的水稻品種才是目標(biāo)所在?，F(xiàn)有的研究顯示，抗性的提高并不意味著Cd吸收﹑積累量的減少，有時(shí)高耐性也伴隨著高積累[8]。因此，考察抗氧化系統(tǒng)對(duì)農(nóng)作物的Cd吸收和積累的影響具有重要意義，但是目前關(guān)于這方面的研究很少。本研究在實(shí)驗(yàn)室以前的調(diào)查研究基礎(chǔ)上初步確定4個(gè)水稻品種五豐優(yōu)2168﹑天優(yōu)998﹑粵香占以及日本晴作為研究材料，首先通過室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，比較4個(gè)品種的Cd吸收﹑轉(zhuǎn)運(yùn)﹑積累方面的差異，對(duì)其積累類型作進(jìn)一步的確認(rèn)與區(qū)分。然后，借助營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)并添加外源Cd處理的方法來探究這些水稻在不同Cd脅迫條件下的Cd吸收﹑積累規(guī)律及抗氧化酶的應(yīng)答機(jī)制，揭示各抗氧化酶組成與水稻Cd吸收的關(guān)系，為高耐性﹑低積累水稻品種的篩選和培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 土培實(shí)驗(yàn)

1.1.1 土壤及處理 稻田0～20cm表層土壤，經(jīng)風(fēng)干，磨碎，過篩。其土壤理化性質(zhì)如下：pH值5.64，有機(jī)質(zhì)9.74%、總氮1.30g/kg、總磷1.13g/kg、總鉀0.60g/kg、總Cd0.23mg/kg；砂質(zhì)∶壤質(zhì)∶粘質(zhì)為30.6∶36.4∶33.0。盆栽實(shí)驗(yàn)處理：CK和Cd（10mg/kg）。稱取1.5kg土壤裝入PVC盆中，Cd處理以Cd（NO3）2 溶液的形式加入，加水混勻后保持水層，平衡20d備用。

1.1.2 水稻品種 4個(gè)品種水稻種子：天優(yōu)998（TY998）﹑粵香占（YXZ）﹑五豐優(yōu)2168（W2168）和日本晴（RBQ）。日本晴和五豐優(yōu)2168兩個(gè)品種在中國廣泛種植。

1.1.3 育苗及種植 4個(gè)水稻品種種子經(jīng)曬種、選種和消毒后，去離子水洗凈，均勻撒播與土砂培養(yǎng)基表面，保持水分，育苗20d。選取大小適中的幼苗移入已裝有土壤的CK及Cd處理盆中，每個(gè)品種每個(gè)處理下4個(gè)重復(fù)，每盆3株。實(shí)驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，自然光加補(bǔ)光燈控制，室內(nèi)溫度控制在26～35℃，相對(duì)濕度70%～85%，定期澆水。分別在孕穗前期﹑灌漿初期及成熟期各收獲一批。將根﹑莖葉及谷粒分開，其中根與莖葉經(jīng)去離子水沖洗干凈后，60℃烘干至恒重，和谷粒一起稱重。

1.1.4 指標(biāo)測(cè)定 將去殼之后的糙米與已經(jīng)烘干的根﹑莖葉用粉碎機(jī)粉碎后，稱取一定量的樣品加濃硝酸（70%優(yōu)級(jí)純），微波消解45min，過濾﹑定容﹑裝管，4℃保存。所有消化樣Cd含量由原子吸收分光光度計(jì)（AAS，Z-230，HITACHI，Japan）測(cè)定。

1.2 水培實(shí)驗(yàn)

1.2.1 水稻品種及育苗方法 同土培試驗(yàn)。

1.2.2 移苗 取生長(zhǎng)狀況一致的水稻幼苗，移至黑色塑料板中，棉花固定，1/2強(qiáng)度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液每3d一換。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方如表1所示。

1.2.3 Cd處理 選取生長(zhǎng)狀況一致的水稻幼苗，分別用0、25﹑50﹑100μmol·L-1Cd濃度營(yíng)養(yǎng)液處理7d，營(yíng)養(yǎng)液為1/2強(qiáng)度。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定 （1）根﹑莖葉Cd含量測(cè)定：同土培試驗(yàn)。（2）各抗氧化指標(biāo)的提取與測(cè)定：①APX提取及測(cè)定方法。取0.3g水稻葉片，在研缽中研磨成粉（加液氮），移入離心管中，加入3mL提取液混勻，4℃下，10 000xg離心30min，取上清液取上清液裝管保存。3mL反應(yīng)體系包括：0.1mol·L-1pH7.5 PBS緩沖液，50μL的酶提取液，0.5mmol·L-1 ASA，最后加入30% H2O2 2μL啟動(dòng)反應(yīng)，空白管不加H2O2，測(cè)定3min內(nèi)A290nm處OD的變化值。A290nm處，抗壞血酸（ASA）的毫摩爾消光系數(shù)為2.8mM-1·cm-1。酶活單位μmol ASA g-1·min-1表示。②GR提取及測(cè)定方法：取0.3g水稻葉片，在研缽中研磨成粉（加液氮），移入離心管中，加入3mL預(yù)冷的提取液混勻，4℃下，10 000xg離心30min，取上清液裝管保存。3mL反應(yīng)體系包括：0.1mol·L-1 pH7.8 PBS緩沖液，2mmol·L-1 Na2EDTA，0.5mmol·L-1 GSSG，酶提取液50μL，最后加入NADPH 3μL啟動(dòng)反應(yīng)，空白管不加NADPH，測(cè)定A340nm處3min內(nèi)OD的變化。A340nm處，NADPH毫摩爾消光系數(shù)為6.2mM-1·cm-1。酶活單位μmol NADPHmg-1·min-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析 利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析和多重比較采用ANOVALSD法，顯著性水平取P<0.05。Origin7.5制作分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻對(duì)Cd的吸收﹑轉(zhuǎn)運(yùn)及積累

2.1.1 土培條件下水稻對(duì)Cd的吸收﹑轉(zhuǎn)運(yùn)及積累 10mg·kg-1Cd處理土培條件下，4個(gè)水稻品種不同生育期收獲后，Cd吸收﹑積累﹑轉(zhuǎn)運(yùn)情況如表2所示。差異性分析結(jié)果表明：（1）在同一生育期，不同水稻品種之間的莖葉Cd含量存在顯著差異。灌漿初期，五豐優(yōu)2168和粵香占莖葉Cd含量顯著高于天優(yōu)998和日本晴。成熟期，五豐優(yōu)2168莖葉Cd含量最高，其次是粵香占，日本晴含量最低。其中五豐優(yōu)2168顯著高于其他3個(gè)品種，和日本晴的差異最大，前者是后者的4.98倍；（2）在同一生育期，不同水稻品種間Cd轉(zhuǎn)移率也存在顯著差異。灌漿初期，粵香占轉(zhuǎn)移率最高，和天優(yōu)998及日本晴差異顯著。成熟期，五豐優(yōu)2168的轉(zhuǎn)移率最高，日本晴最低；（3）五豐優(yōu)2168的糙米Cd含量最高，且其和粵香占的糙米Cd含量顯著高于日本晴。

2.1.2 水培條件下水稻不同部位Cd吸收 不同濃度Cd處理后，各品種水稻莖葉及根部Cd含量如表3所示。隨著Cd處理濃度的增加，各品種水稻莖葉及根部Cd含量有逐漸增加的趨勢(shì)。差異性分析結(jié)果表明：25μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168和粵香占根部Cd含量顯著高于天優(yōu)998和日本晴（P<0.05），但4個(gè)品種莖葉Cd含量無顯著差異。50μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168莖葉Cd含量最高，但各品種根部Cd含量無顯著差異。100μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168各部Cd含量顯著高于日本晴，但與粵香占和天優(yōu)998之間差異不顯著。

2.2 不同濃度Cd處理?xiàng)l件下抗氧化酶對(duì)水稻Cd吸收的影響

2.2.1 水稻抗氧化酶對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答 不同濃度Cd處理后，4個(gè)品種水稻地上部APX活性變化如圖1所示。結(jié)果顯示：正常生長(zhǎng)條件下，4個(gè)品種水稻之間APX活性無顯著差異。25μM Cd濃度下，日本晴APX活性顯著低于其他品種。50μM濃度下，五豐優(yōu)2168和粵香占APX活性顯著高于日本晴和天優(yōu)998。100μM濃度下，五豐優(yōu)2168和日本晴之間APX活性差異顯著，前者高于后者。

不同濃度Cd處理后，4個(gè)品種水稻地上部GR活性變化如圖2所示。結(jié)果顯示：25μM濃度下，天優(yōu)998GR活性顯著高于粵香占和日本晴，粵香占和日本晴的GR活性顯著高于五豐優(yōu)2168。50μM濃度下，天優(yōu)998和日本晴的GR活性顯著高于五豐優(yōu)2168和粵香占。100μM濃度下，4個(gè)品種間GR活性無顯著差異。

2.2.2 相關(guān)性分析 0～100μM范圍內(nèi)的不同濃度Cd處理水培條件下，地上部Cd含量與地上部抗氧化指標(biāo)活性相關(guān)關(guān)系如表4所示。相關(guān)性性分析結(jié)果表明：APX與莖葉Cd含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，GR相反。且地上部Cd含量與抗氧化指標(biāo)活性或含量之間存在顯著相關(guān)性（P<0.05）.APX活性與莖葉Cd含量之間在25μM﹑50μM﹑100μM Cd濃度處理下均存在顯著正相關(guān)。GR活性與莖葉CD含量之間在50及100μM Cd濃度處理下顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

土培和水培試驗(yàn)中，供試的4個(gè)水稻品種在莖葉Cd含量﹑根部Cd含量﹑Cd由根部向地上部的轉(zhuǎn)移率﹑谷粒Cd積累量方面均存在顯著差異（P<0.05，表2，表3）。這表明，水稻對(duì)Cd的吸收及積累存在品種間差異。事實(shí)上，本研究中我們發(fā)現(xiàn)，10mg·kg-1Cd土培實(shí)驗(yàn)中，五豐優(yōu)2168和日本晴之間在不同生育期下的根部Cd含量﹑莖葉Cd含量﹑Cd由根向地上部的轉(zhuǎn)移率﹑谷粒Cd積累量方面均存在顯著差異（P<0.05，表2）。其中前者的積累量顯著高于后者。不同濃度Cd處理水培實(shí)驗(yàn)中，25μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168根部Cd含量顯著高于日本晴（P<0.05，表3）。50μM Cd和100μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168各部Cd含量均顯著高于日本晴（P<0.05，表3）。因此，為便于后續(xù)分析，本研究將五豐優(yōu)2168定義為Cd高積累型品種，日本晴定義為Cd低積累型品種。

水培實(shí)驗(yàn)中，APX活性方面，25μM﹑50μM﹑100μM Cd處理下，五豐優(yōu)2168的APX活性顯著高于日本晴（P<0.05，圖1）。25μM和50μM處理下，天優(yōu)998和日本晴的GR活性顯著高于五豐優(yōu)2168和粵香占（P<0.05，圖2）。此外，本文還對(duì)水稻地上部Cd含量與抗氧化指標(biāo)活性或含量的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種Cd濃度處理下，APX與莖葉Cd含量之間呈正相關(guān)關(guān)系，且某些處理下顯著正相關(guān)（P<0.05，表4）。通過前面的土培及水培實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可知五豐優(yōu)2168的籽粒Cd積累量較高，而日本晴正好相反。綜合以上結(jié)果，推測(cè)APX活性的提高在增強(qiáng)水稻的Cd抗性的同時(shí)，也可能間接促使水稻吸收更多的Cd，即高抗性﹑高吸收。有學(xué)者通過比較超富集植物天藍(lán)遏藍(lán)菜和非超富集植物煙草在Cd處理下體內(nèi)的過氧化物和抗氧化酶含量，發(fā)現(xiàn)Cd超富集植物具有更強(qiáng)的抗氧化能力；煙草的生長(zhǎng)明顯受到抑制，而天藍(lán)遏藍(lán)菜卻能正常生長(zhǎng)。由于天藍(lán)遏藍(lán)菜具有較強(qiáng)的抗氧化防御能力，所以它對(duì)重金屬的富集和耐受能力也很強(qiáng)[9]。同理，4種Cd濃度處理下，GR與莖葉Cd含量之間均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，且GR在某些處理下與莖葉Cd含量之間顯著正相關(guān)（P<0.05，表4）。這一結(jié)果表明，GR活性的提高的同時(shí)，水稻對(duì)Cd的吸收減少。

總之，本研究結(jié)果表明，抗氧化系統(tǒng)各組分對(duì)水稻Cd吸收及積累的影響力是不同的，本研究發(fā)現(xiàn)GR抗氧化酶活性的提高在增強(qiáng)水稻Cd抗性的同時(shí)，在減少Cd吸收方面也起到積極的作用，但APX活性的提高在增強(qiáng)水稻的Cd抗性的同時(shí)，可能會(huì)間接促使水稻吸收更多的Cd。雖然機(jī)理方面的原因尚待進(jìn)一步探究，但這一研究結(jié)果為Cd低積累水稻品種的分子育種提供了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭陶，李廷軒，張錫洲，等.水稻鎘高積累品種對(duì)鎘的富集特性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（7）：1492-1500.

[2]陳會(huì)，任艷芳，陳秀蘭，等.鎘脅迫下不同耐性水稻植株幼苗生長(zhǎng)和抗氧化酶的變化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：1099-1104.

[3]史靜，潘根興，張乃明，等.鎘脅迫對(duì)不同雜交水稻品種Cd Zn吸收與積累的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（10）：2904-2910.

[4]孔祥瑞.自由基及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生物科學(xué)動(dòng)態(tài)，1984，4：11-18.

[5]Pietrini F，Iannelli MA，Pasqualini S，et al.Interaction of cadimium with glutathione and photosynthesis in developing leaves and chloroplasts of Phragmites australis（Cav.）Trin ex Steudel[J].Plant Physiol.，2003，133（2）：829-837.

[6]Shah K，Kumar RG，Verma S，et al.Effects of cadmium on lipid peroxidation，superoxide anion generation and activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings[J].Plant Sci.，2001，161：1135-1144.

[7]Foyer CH，Deseourvierse P，Kunert KJ.Protection against oxygen radicals：an important defence mechanism studied int transgenic plants[J].Plant Cell Environ.，1994，17：507-523.

[8]Cao X，Ma LQ.Antioxdative responses to arsenic in the arsenic-hyperaccumulator Chinese brake fern（Pteris vittata L.）[J].Environ Pollut，2004，128（3）：317.

[9]Boominathan R，Doran P M.Cadmium tolerance and antioxidative defenses in hairy roots of the cadmium hyperaccumu-lator，Thlaspi caerulescens[J].Biotechnol Bioeng，2003，83（2）：158–167.

（責(zé)編：張宏民）