多劑量水合氯醛溶液及糖漿劑微生物限度方法的建立及驗證

石　珊， 金　霏， 王寧寧， 周　卓

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部， 沈陽　110005； 2中國醫(yī)藥集團總公司， 北京　100088)

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·藥學(xué)研究·

多劑量水合氯醛溶液及糖漿劑微生物限度方法的建立及驗證

石珊1， 金霏1， 王寧寧1， 周卓2

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部， 沈陽110005；2中國醫(yī)藥集團總公司， 北京100088)

目的建立水合氯醛溶液及糖漿劑的微生物限度檢查法并對中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部生產(chǎn)的水合氯醛溶液及糖漿劑進行檢查。方法按照《中國藥典》(2010版)規(guī)定，采用薄膜過濾法檢查水合氯醛溶液樣品和糖漿劑樣品在常溫和冷藏條件下放置0、7、14、28 d時微生物的生長情況。結(jié)果水合氯醛溶液及糖漿劑均具有抑菌活性，各菌薄膜過濾法回收率均>70%，能有效地去除其抑菌活性，水合氯醛溶液及糖漿劑樣品在冷藏和常溫下保存28 d時微生物檢查結(jié)果均合格。結(jié)論用薄膜過濾法進行微生物限度檢查可以客觀反映藥物中微生物的污染情況，能夠滿足日?？焖贉?zhǔn)確的檢驗。

水合氯醛溶液； 水合氯醛糖漿； 薄膜過濾法； 微生物限度檢查

水合氯醛作為臨床常用的鎮(zhèn)靜催眠藥，用藥過程安全平穩(wěn)，口服起效迅速，給藥方式多樣，催眠效果好,不良反應(yīng)少。其在醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)不僅應(yīng)用于成人的鎮(zhèn)靜催眠，也被廣泛用于兒科的檢查和治療中[1]。由于溶液劑對消化道黏膜有輕微刺激，味道苦澀，口感差，因此常用于成人口服或兒童肛門給藥。為了使患兒更易接受，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備有水合氯醛糖漿劑，可以掩蓋水合氯醛的不良?xì)馕?，改善口感。因此，?yīng)對不同的患者的需求，我院制備有10%水合氯醛溶液和10%水合氯醛糖漿劑2種水合氯醛制劑。水合氯醛本身具有抑菌活性[2]，目前常規(guī)采用直接接種法、培養(yǎng)基稀釋法等檢驗方法[3-4]，能受到藥物自身的抑菌作用的影響，干擾微生物限度檢查結(jié)果，故本研究依據(jù)《中國藥典》(2010 年版)二部[5]的附錄XI J《微生物限度檢查法》中驗證要求，采用薄膜過濾法分別建立水合氯醛溶液及糖漿劑的微生物限度檢查方法用于驗證，并應(yīng)用于樣品的檢驗。

1　材料與方法

1.1實驗藥品、儀器和菌種大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕,金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕,白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63501〕,黑曲霉菌(Aspergilus niger)〔CMCC(F)98003〕,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：1309272北京三藥科技開發(fā)公司),改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號：121015北京三藥科技開發(fā)公司),隔水式恒溫培養(yǎng)箱(細(xì)菌)(上海新苗GNP-9080BS-Ⅲ),霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊NJX-250B-Z),高壓蒸汽滅菌器(上海申安SYQ-DSX-280B),振蕩器(常州國華HY-2),菌落計數(shù)器(Galazy230)，電子天平(上海光正YP10002),潔凈工作臺(蘇州安泰SW-CJ-IBU),大容量電動移液器(EP03490),麥?zhǔn)媳葷峁?泰生物 YZB/浙溫0167-2012),水合氯醛〔玉龍海藻有限公司 批號(20141001)〕,單糖漿〔自制批號(20141201)〕。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的制備精密稱取水合氯醛10 g，溶于100 mL容量瓶中，配制成水合氯醛濃度為10%的溶液，過濾，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色磨口瓶中備用。精密稱取水合氯醛10 g，加入適量水溶解于100 mL容量瓶中，加入單糖漿65 mL，配制成水合氯醛濃度為10%的糖漿劑，過濾，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色磨口瓶中備用。

1.2.2菌液制備菌液制備 按照《中國藥典》(2010版)二部[2]的附錄XI J《微生物限度檢查法》方法制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉菌液，備用。

1.2.3供試品溶液制備取供試品10 mL，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL，混勻，為1∶10 的供試液。

1.2.4微生物計數(shù)方法學(xué)驗證采用薄膜過濾法進行3次獨立的平行試驗。供試品對照組：在pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入10 mL 的供試液，配制成100 mL溶液，混勻，過濾，沖洗濾膜。試驗組：方法同供試品對照組，于最后1 次沖洗液中滴入1 mL試驗菌液。菌液組：在pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入1 mL菌液，配制成100 mL溶液，混勻，過濾，沖洗濾膜。稀釋劑對照組： 取稀釋劑10 mL代替供試液，其余方法同供試品對照組。按規(guī)定時間培養(yǎng)，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果并測定菌數(shù)。

回收率計算：試驗組菌回收率=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)×100%，稀釋劑對照組回收率=(稀釋劑對照組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)×100%。

1.2.5控制菌檢查方法驗證試驗組：取10 mL供試液和上述含10～100 cfu大腸埃希菌試驗菌1 mL，滴入盛有100 mL BL培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)24 h。陰性對照組：取10 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，加入盛有100 mL 膽鹽乳糖培養(yǎng)基的三角瓶中，自培養(yǎng)24 h 。培養(yǎng)后將三角瓶中的培養(yǎng)物劃線在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，試驗組檢出了大腸埃希菌而陰性對照組未檢出，說明可采用薄膜過濾法對本品進行控制菌(大腸埃希菌)檢查。

1.2.6樣品測定方法采用上述驗證后的薄膜過濾法，分別對冷藏和常溫條件下模擬常規(guī)情況(每日開啟3次)的10%水合氯醛溶液和10%水合氯醛糖漿劑進行測定微生物限度檢查。

2　結(jié)果

2.1微生物限度方法驗證結(jié)果使用薄膜過濾法進行各菌回收率測定，水合氯醛溶液的各菌回收率為80.9%～116.0%；糖漿劑各菌回收率為75.9%～108.0%，均>70%，說明這兩種制劑的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)可采用薄膜過濾法,見表1、表2。

2.2樣品測定結(jié)果10%水合氯醛溶液和10%糖漿劑在未添加防腐劑時，在冷藏或常溫條件下放置28 d時微生物檢查結(jié)果合格，說明配制后的多劑量水合氯醛制劑可以在冷藏和常溫下放置28 d(表3～5)。

表1　水合氯醛溶液薄膜過濾法方法學(xué)驗證結(jié)果

表2　水合氯醛糖漿劑薄膜過濾法方法學(xué)驗證結(jié)果

表3　冷藏條件下不同時間水合氯醛溶液樣品測定結(jié)果

表4　常溫條件下不同時間水合氯醛溶液樣品測定結(jié)果

表5　冷藏條件下不同時間水合氯醛糖漿劑樣品測定結(jié)果

表6　常溫條件下不同時間水合氯醛糖漿劑樣品測定結(jié)果

3　討論

初曉等[2]報道：水合氯醛對于金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為 6.25×103g/mL，最低殺菌濃度為 6.25×103g/mL。水合氯醛自身的殺菌作用，使配制的溶液不易受細(xì)菌感染，在不加任何防腐劑的情況下，在實驗測定的時間內(nèi)不生長細(xì)菌和霉菌。水合氯醛在光照、熱、遇酸、堿都會降解，自身的濃度受到影響[6-9]，抑菌效果也不同。本實驗采用薄膜過濾法，去除了藥物自身的抑菌作用的影響，建立的方法簡便、準(zhǔn)確。

醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)常用的水合氯醛制劑為多劑量劑型，配制后溶液需多次開啟，而多次開啟也容易造成制劑的污染。為使實驗結(jié)果更貼近真實情況，本實驗在對樣品進行檢查時模擬每天開啟3次容量瓶，使得結(jié)果更貼近實際情況。

[1]柯輝，雷美容，馬曉玉.水合氯醛兒科臨床應(yīng)用新進展[J].護理研究，2011，25(11)：3022-3024.

[2]初曉，劉愛明，李偉.水合氯醛對大腸桿菌金黃色葡萄球菌抗菌效能的測定[J].中國藥師，2003，6(7)：415.

[3]杜建紅，張國慶，方晨,等.水合氯醛合劑微生物限度檢查的驗證[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2014，11(5)：21-23.

[4]區(qū)潔雯，呂錦俊.水合氯醛糖漿微生物限度檢查方法的驗證[J].中國藥房，2014,25(21)：1998-2000.

[5]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2010 年版)二部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄XI J.

[6]趙可新，徐列兵.水合氯醛合劑中水合氯醛穩(wěn)定性考察試驗[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2005,18(1)：4-5.

[7]劉佳，姜清華，楊躍輝.水合氯醛溶液穩(wěn)定性考察[J].實用藥物與臨床，2013，16(8)：720-721.

[8]張華，石磊.水合氯醛溶液中主成分穩(wěn)定性考察[J].中國藥師，2014，17(1)：168-169.

[9]趙蕾，唐輝，袁天榮,等.水合氯醛糖漿生產(chǎn)工藝的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(4)：38-40.

(本文編輯楊晨晨)

The establishment and validation of microbial limit test with chloral hydrate solution and chloral hydrate syrup in multi-dose bottles

SHI Shan1， JIN Fei1， WANG Ningning1， ZHOU Zhuo2

(1DepartmentofPharmacy，theFirstAffliatedHospitalofChineseMedicalUniversity，Shenyang110005，China；2ChinaNationalPharmaceuticalGroupCorporation，Beijing100088，China)

ObjectiveTo establish and verify the microbial limit test for chloral hydrate solution and chloral hydrate syrup. MethodsIn accordance with Chinese Pharmacopoeia (2010 Edition), membrane filtration method was used to examine microbial growth of the samples on the 0 d, 7 d, 14 d, 28 d, in the condition of room temperature and cold storage. ResultsChloral hydrate solution and chloral hydrate syrup had antimicrobial activity， the recovery rates of membrane filtration method were higher than 70%，which could effective eliminate the antibacterial activity. And the microbial examination results were qualified for the preservation of the chloral hydrate solution and chloral hydrate syrup for 28 d in room temperature or cold storage. ConclusionThe membrane filtration method can be used for the microbial limit test, which can directly show the condition of bacterial contamination of drugs so as to achieve the purpose of test.

chloral hydrate solution； chloral hydrate syrup； membrane filtration method； microbial limit tests

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部科研專項基金(20140305)

石珊(1981-)，女，碩士，主管藥師,研究方向：臨床藥學(xué)及藥物制劑學(xué),E-mail: shshcmu@163.com。

R286.0

A

1009-5551(2016)10-1299-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.021

2016-08-03]