miR—148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

張軍港 石英 黃東勝 張成武 洪德飛

[摘要] 目的 探討miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響。 方法 分別使用50 nmol/L的miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-148b表達(dá)的變化。通過(guò)β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老的變化，應(yīng)用western blot檢測(cè)P21表達(dá)的影響。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，miR-148b能明顯增加肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)。50 nmol/L的 miR-148b轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)變得大而扁平，衰老細(xì)胞比例明顯增加[（9.67±2.08）% vs （43.67±3.51）%，P<0.01]。miR-148b使肝癌細(xì)胞P21蛋白的表達(dá)也明顯增加。 結(jié)論 miR-148b可能通過(guò)影響P21的表達(dá)促進(jìn)肝癌SMMC7721細(xì)胞的衰老，miR-148b有可能成為肝癌SMMC7721細(xì)胞生物治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 肝癌；miR-148b；衰老；P21

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）05-0025-04

microRNAs是一類長(zhǎng)度為20～24 bp、具有基因調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，主要通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定及翻譯調(diào)控基因表達(dá)功能[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-4]。miR-148b在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的生物學(xué)功能及預(yù)后密切相關(guān)。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與肝癌的增殖侵襲密切相關(guān)[5，6]，目前miR-148b對(duì)肝癌細(xì)胞衰老的影響機(jī)制尚不清楚。本研究在2013年10～12月將50 nmol/L的miR-148b的類似物轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細(xì)胞48 h后，觀察對(duì)細(xì)胞衰老特性及衰老相關(guān)蛋白P21的影響，為探討miR-148b作為肝癌治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司， 肝癌細(xì)胞系SMMC7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司。miR-148b mimics（miR-148b）和negative control（miR-NC）轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。LipofectmanineTM2000及Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人P21和GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌SMMC7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、含5%CO2培育箱下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR） 采用TaKaRa公司的試劑盒，miR-148b和內(nèi)參U6的引物探針由廣州瑞博公司設(shè)計(jì)合成。miR-148b：5-AAGTTCTGTTATACACTCAGGC-3，內(nèi)參基因U6：5-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3。反應(yīng)體系為 SYBRR Green qRT-PCR Mix（2×）10 μL，PCR Forward Primer和Reverse Primer各0.4 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，cDNA 1 μL。其反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s， 60℃ 30 s×40循環(huán)，儀器為ABI公司7500型Real-time PCR儀。ABI step-one附帶qRT-PCR分析軟件分析CT（cycle threshold）值。目的基因RNA的相對(duì)表達(dá)量=2-Δ Δ CT， Δ Δ CT=待測(cè)樣本（CT目的基因-CT內(nèi)參）-對(duì)照組（CT目的基因-CT內(nèi)參）。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后離心后重懸，以1×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，貼壁 24 h 后用細(xì)胞衰老檢測(cè)試劑盒染色，在37℃孵育過(guò)夜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)均勻一致藍(lán)色細(xì)顆粒表示β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性，即細(xì)胞出現(xiàn)衰老改變。

1.2.4 Western blot檢測(cè)P21蛋白的變化 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后， 提取細(xì)胞蛋白?？偟鞍滋崛》椒▍⒄誃eyotime公司操作說(shuō)明進(jìn)行。分別將相同適量蛋白含量的樣品和2×蛋白上樣緩沖液等體積混合，沸水中煮5 min使蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后 5 g/L脫脂奶粉封閉，加入1：1000稀釋的一抗，4℃過(guò)夜，加入1∶2000稀釋的二抗，室溫1 h，TBS漂洗膜，ECL增強(qiáng)發(fā)光，X線曝光。以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，BANDSCAN圖像分析軟件光密度積分值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞中miR-148b表達(dá)的影響

將50 nmol/L miR-148b或miR-NC作用SMMC 7721細(xì)胞48 h，采用qRT-PCR的方法，檢測(cè)miR-148b表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比（1.00±0.08），miR-148b明顯增加了肝癌細(xì)胞miR-148b的表達(dá)（151.22±9.77），差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.73，P<0.01）（圖1）。

2.2 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老的影響

將50 nmol/L miR-148b 或miR-NC作用SMMC7721細(xì)胞48 h，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-148b處理組的部分細(xì)胞形態(tài)變得更加大而扁平（封三圖1A）。進(jìn)一步采用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（9.67±2.08）%相比，miR-148b引起的衰老細(xì)胞比率明顯增加（43.67±3.51）%，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.42，P<0.01）（封三圖1B）。

2.3 miR-148b對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老相關(guān)p21蛋白的影響

采用Western blot方法檢測(cè)P21蛋白變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，50 nmol/L的miR-148b作用SMMC 7721細(xì)胞48 h后，P21蛋白的表達(dá)明顯增加（圖2A）。具體灰度值變化見圖2B（灰度值：1.16±0.02 vs 0.77±0.03），差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.89，P<0.01）（圖2B）。

3 討論

肝癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一。由于肝癌的發(fā)病隱匿，早期無(wú)特異性的臨床癥狀，且病程進(jìn)展迅速，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的自覺(jué)癥狀時(shí)，往往已到了中晚期[7]。目前肝癌的治療仍以手術(shù)為主，而不能手術(shù)的患者則以化療為主。手術(shù)的效果受限于手術(shù)時(shí)機(jī)，而化療藥物易產(chǎn)生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高。因此迫切需要尋找有效地早期生物標(biāo)志物機(jī)開發(fā)新的有效藥物治療肝癌。

肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多步驟多階段的病理過(guò)程， 涉及到很多相關(guān)癌基因和抑癌基因的變化。研究結(jié)果顯示，microRNA可能通過(guò)類似于抑癌基因、癌基因或其它方式來(lái)調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程，表現(xiàn)為同抑癌基因或癌基因相似的生物學(xué)效應(yīng)[8]。microRNA主要通過(guò)與特定靶基因mRNA 的 3-非翻譯區(qū)（3-UTR）完全或不完全配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老和代謝等生命活動(dòng)的調(diào)控[2，9，10]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-148b參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Ghasemkhani N等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在肺癌中低表達(dá)，同肺癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在胰腺癌低表達(dá)，通過(guò)影響AMPKα1信號(hào)通路影響腫瘤的生物學(xué)行為。我們前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-148b在肝癌中低表達(dá)，通關(guān)過(guò)調(diào)控WNT1/β-catenin通路抑制肝癌的增殖和侵襲行為[5]。然而miR-148b同肝癌細(xì)胞衰老的關(guān)系未做進(jìn)一步研究。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞不可逆地離開細(xì)胞周期、發(fā)生形態(tài)及細(xì)胞學(xué)改變的現(xiàn)象。細(xì)胞衰老作為細(xì)胞潛在的抗腫瘤機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要屏障作用，能夠有效防止腫瘤發(fā)生[13，14]。

本研究結(jié)果顯示miR-148b能夠使SMMC7721中的miR-148b表達(dá)明顯增加，miR-148b使SMMC 7721細(xì)胞的形態(tài)變得大而扁平，呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miR-148b使β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-148b能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老，使肝惡性腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為發(fā)生一定程度逆轉(zhuǎn)。

P21是細(xì)胞周期調(diào)控家族的重要成員之一，是依賴于細(xì)胞周期蛋白激酶（CDK）的抑制物，它能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期過(guò)程，參與細(xì)胞的增殖、分化、衰老及死亡過(guò)程[15-17]。已知P21是通過(guò)依賴p53和不賴p53的途徑調(diào)節(jié)的。既往研究發(fā)現(xiàn)，P21能增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，而ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸能夠明顯阻止P21誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，表明P21可能通過(guò)ROS積聚機(jī)制誘導(dǎo)衰老[18]。Hu B等[19]研究發(fā)現(xiàn)女貞果實(shí)提取物通過(guò)正調(diào)控P21誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老和凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)阿霉素能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌野生型HCT-116細(xì)胞發(fā)生衰老樣生長(zhǎng)停滯，而這種作用對(duì)敲除P21的HCT-116細(xì)胞株作用大大降低，表明P21在結(jié)腸癌的衰老過(guò)程中起重要作用[20]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-148b能夠使P21蛋白的表達(dá)量明顯增加，表明miR-148b可能通過(guò)調(diào)通P21的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的衰老過(guò)程。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-148b能夠通過(guò)調(diào)控P21來(lái)誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細(xì)胞衰老，我們將進(jìn)一步深入研究miR-148b在肝癌中的功能和調(diào)控分子機(jī)制，系統(tǒng)闡明miR-148b參與肝癌發(fā)生發(fā)展可能的機(jī)制，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2015-11-05）