賴氨酸缺乏或過量對肉雞生長發(fā)育及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

田大龍 ，李燕蒙，閔育娜，王哲鵬，劉福柱，牛竹葉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

賴氨酸是家禽玉米-豆粕型日糧中的第二限制性氨基酸，當(dāng)豆粕不作為日糧蛋白主要來源時，賴氨酸成為家禽日糧的第一限制性氨基酸，其主要用于蛋白質(zhì)合成，因此被稱為“生長性氨基酸”[1]。肝臟是家禽脂肪代謝的主要場所，脂肪細(xì)胞產(chǎn)生很少量或是不能產(chǎn)生脂肪，脂肪的合成代謝幾乎完全在肝臟[2]。有研究表明，日糧賴氨酸顯著影響肉仔雞的脂肪代謝[3-4]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，近年來開展的許多功能基因和候選基因的研究證實(shí)了過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等基因與脂肪代謝相關(guān)[5]。目前，關(guān)于賴氨酸的研究多集中于肉雞的賴氨酸需要量、生產(chǎn)性能等方面，而賴氨酸調(diào)控肉雞生長發(fā)育的分子機(jī)制的研究較少。本試驗(yàn)主要測定賴氨酸缺乏或過量對肉雞5個肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP1）、PPARs、ACC、蘋果酸酶（ME）、SREBP-1表達(dá)特性的影響，旨在基于肉雞脂質(zhì)代謝層面初步探討賴氨酸調(diào)控肉雞生長發(fā)育和脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制，為深入揭示賴氨酸調(diào)控肉雞生長發(fā)育的分子機(jī)制提供有益的積累。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)日糧 選用1日齡AA肉仔公雞360只，隨機(jī)分成3個處理，每處理6個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。組間初始體重差異不顯著。

基礎(chǔ)日糧參照 NRC（1994）肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，采用玉米-玉米蛋白粉型基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧中賴氨酸含量為0.60%，在基礎(chǔ)日糧中添加L-賴氨酸鹽酸鹽（98%）配制成3種賴氨酸水平分別為0.60%（缺乏，LL）、1.00%（適量，ML）、1.40%（過量，HL）的試驗(yàn)日糧，試驗(yàn)期3周?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 1～21日齡肉仔雞基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)動物的飼養(yǎng)管理 飼養(yǎng)試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧生態(tài)養(yǎng)殖場進(jìn)行，各組的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。試驗(yàn)雞舍采用人工控溫，前期維持每天23 h光照，雛雞舍溫度在前3 d保持在33～35℃，濕度保持在65%以上，之后平均每周降溫2～3℃，直至降到25℃左右停止供溫。舍飼籠養(yǎng)，粉料飼喂，自由采食、飲水，依常規(guī)程序進(jìn)行雞舍消毒、免疫防治及其他管理。

1.3 樣品采集 試驗(yàn)第21天時每個重復(fù)抽取1只接近該重復(fù)平均體重的雞，空腹12 h，稱重記錄，自由飲水，于第2天08:00時，屠宰前翅靜脈采血5 mL，3 000 r/min 離心15 min，取血清于離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采血后解剖，分別取肝臟、胸肌、腿肌和腹脂（包括腹部脂肪和肌胃周圍的脂肪）稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)、胸肌率、腿肌率、腹脂率（與活重的比值）。取部分肝臟組織樣于凍存管置于液氮，用于分析脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對表達(dá)量。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能 1日齡以重復(fù)為單位進(jìn)行稱重，記為初始體重；以重復(fù)為單位，測定試驗(yàn)期第21天雞的空腹體重；計(jì)算1～21日齡的平均日增重（ADG）。在整個試驗(yàn)期每周統(tǒng)計(jì)各重復(fù)采食量，計(jì)算1～21日齡試驗(yàn)期間的平均日采食量（ADFI）。計(jì)算耗料增重比（F/G）。

1.4.2 血清生化 血清中總蛋白、白蛋白、尿酸、尿素氮、總膽固醇和甘油三酯含量用全自動生化分析儀進(jìn)行測定（HATICHI 7180，日本）。

1.4.3 組織器官發(fā)育 分別取肝臟、胸肌、腿肌和腹脂進(jìn)行稱重，計(jì)算部分器官指數(shù)。

1.4.4 肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄檢測選用β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，內(nèi)參和目的基因引物根據(jù)GenBank中雞的相關(guān)cDNA序列設(shè)計(jì)，引物均由廣州賽哲生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。采用Trizol（TaKaRa公司）試劑盒提取肉雞肝臟組織總RNA，按照Promega A5001試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用Real-PCR法測定肝臟中FABP1、PPARɑ、ACC、ME、SREBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后，采用SPSS 21.0軟件，以ML組為對照，分別與LL組、HL組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因與ADG和腹脂率進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 賴氨酸缺乏或過量對肉雞生長性能的影響 由表3可知，與ML組相比，LL組極顯著降低了肉雞ADG、ADFI（P＜0.01），極顯著增加了肉雞的F/G（P＜0.01）。HL組肉雞ADG、ADFI和F/G與ML組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 引物序列及參數(shù)

表3 賴氨酸缺乏或過量對肉雞生長性能的影響（n=120）

2.2 賴氨酸缺乏或過量對肉雞血清生化指標(biāo)的影響 由表4可知，與ML組相比， HL組肉雞血清尿素氮、尿酸顯著升高（P＜0.05）； 與ML組相比，LL、HL組肉雞血清總膽固醇和甘油三酯均有升高的趨勢（P＜0.10）。

表4 賴氨酸缺乏或過量對肉雞血清生化指標(biāo)的影響（n=6）

2.3 賴氨酸缺乏或過量對肉雞肝臟指數(shù)、胸肌率、腿肌率、腹脂率的影響 由表5可知，與ML組相比，LL組極顯著降低了肉雞的胸肌率（P＜0.01），顯著降低了腹脂率（P＜0.05），肝臟指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。HL組肉雞胸肌率、腿肌率、肝臟指數(shù)與ML組無顯著差異（P＞0.05）。

表5 賴氨酸缺乏或過量對肉雞肝臟指數(shù)、胸肌率、腿肌率、腹脂率的影響（n=6）

2.4 賴氨酸缺乏或過量對肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖1可知，與ML組相比，LL、HL組顯著降低了肝臟中FABP1、ACC、ME、SREBP-1 mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05），而HL組顯著降低了PPARɑ mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05），LL組對PPARɑ mRNA相對表達(dá)量沒有顯著影響（P＞0.05）。

圖1 賴氨酸缺乏或過量對肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響（n=6）

2.5 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)與ADG和腹脂率的相關(guān)分析由表6可知，肝臟FABP1、SREBP-1基因mRNA表達(dá)量與肉雞ADG顯著正相關(guān)（P＜0.05）；FABP1、ACC基因mRNA表達(dá)量與肉雞腹脂率顯著正相關(guān)（P＜0.05）。肝臟FABP1基因mRNA 表達(dá)量與肝臟ACC、ME、SREBP-1基因mRNA 表達(dá)量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。肝臟PPARɑ基因mRNA表達(dá)量與肝臟ME基因mRNA表達(dá)量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。肝臟ACC基因mRNA 表達(dá)量與肝臟ME、SREBP-1基因mRNA 表達(dá)量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。肝臟ME基因mRNA 表達(dá)量與肝臟SREBP-1基因mRNA表達(dá)量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。肉雞ADG與肝臟PPARɑ、ACC、ME基因mRNA 表達(dá)量無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。肉雞腹脂率與肝臟PPARɑ、ME、SREBP-1基因mRNA 表達(dá)量無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。

表6 基因表達(dá)相關(guān)分析（n=6）

3 討 論

3.1 賴氨酸缺乏或過量對肉雞生長發(fā)育的影響 本研究結(jié)果顯示，當(dāng)賴氨酸缺乏時，肉雞的ADG、ADFI和腹脂率顯著降低。這與前人的研究結(jié)果一致[6-10]。此外，氨基酸的過量添加會導(dǎo)致胴體脂肪率的降低[11]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)賴氨酸過量時，肉雞的ADG、ADFI、腹脂率減少，這與Cengiz等[9]的研究結(jié)果一致。Cengiz等[9]發(fā)現(xiàn)，過量添加賴氨酸降低了0～21日齡肉仔雞公雞的體增重、屠體重和胴體重。

血清甘油三酯、總膽固醇等能反映動物體內(nèi)脂肪的代謝情況。關(guān)于賴氨酸水平對家禽血清中甘油三酯影響的研究結(jié)果不一致。張婷等[4]、王文策等[12]報(bào)道，血清中的甘油三酯含量會隨著賴氨酸的升高而呈先升高后降低的趨勢。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧賴氨酸無論缺乏或過量，血清總膽固醇和甘油三酯都有升高的趨勢，這與劉升軍等[13]研究結(jié)果一致。以上說明賴氨酸缺乏或者過量可能會導(dǎo)致氨基酸失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生變化。尿酸、尿素氮是反映家禽體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，家禽體內(nèi)未被利用的氨基酸最終以尿酸的形式排出體外。本研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸過量時，血清尿素氮、尿酸顯著升高。這可能是賴氨酸過量導(dǎo)致自身及其他氨基酸的利用率降低、蛋白質(zhì)代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致血清尿酸含量升高。

3.2 賴氨酸缺乏或過量對肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 肝臟是家禽中脂肪酸合成的主要部位[14]。肝臟脂肪酸代謝是最重要的脂質(zhì)代謝途徑，可以改變脂肪沉積[15]。ACC和ME能夠調(diào)節(jié)脂肪代謝[5]。在本研究中，賴氨酸過量引起肉雞肝組織ACC和ME的表達(dá)顯著下調(diào)。ACC是脂肪酸合成的限速酶，催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)，即乙酰輔酶A對丙二酰輔酶A的生物合成，隨著體脂的增加，ACC活性增加[16]。ME是調(diào)節(jié)蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶，在丙酮酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸的途徑中提供還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和草酰乙酸。ME合成的NADPH是影響脂肪合成的重要因素[17]。以上分析表明，賴氨酸過量有抑制脂肪合成的效果。在本研究中，賴氨酸過量顯著降低了SREBP-1的mRNA表達(dá)水平。SREBP-1是脂肪酸合成酶的轉(zhuǎn)錄因子，正調(diào)控脂肪酸合成的基因（ACC和FAS）表達(dá)[18-19]。說明賴氨酸過量可能通過抑制SREBP-1的表達(dá)來抑制脂肪生成，最終導(dǎo)致肉雞腹部脂肪沉積減少[20]。此外，賴氨酸過量也顯著降低了肝組織中PPARa的表達(dá)。PPARa作為配體活化核受體參與脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與肝脂肪酸氧化。PPARa的激活誘導(dǎo)了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，導(dǎo)致脂肪酸合成表達(dá)減少。PPARa通過增加PPARa靶基因的表達(dá)來增加脂肪酸的氧化[21-23]。

本研究結(jié)果也顯示，賴氨酸缺乏降低了ME、SREBP-1、ACC和FABP1基因的 mRNA 表達(dá)量。其中，ME、SREBP-1、ACC均可促進(jìn)脂肪的合成，F(xiàn)ABP1作為肝脂代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與脂質(zhì)β-氧化，可能通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞PPARa表達(dá)影響脂質(zhì)代謝[24-25]。這說明賴氨酸缺乏時，下調(diào)脂肪合成的關(guān)鍵基因?qū)е赂怪式档汀?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸缺乏及其導(dǎo)致的氨基酸不平衡顯著降低了肝臟脂肪酸的合成基因ACC、ME、SREBP-1的表達(dá)，可能是由于日糧賴氨酸缺乏使脂肪合成減少[26]，肝臟脂肪酸的合成基因表達(dá)下調(diào)。賴氨酸過量也類似地顯著降低了肝臟脂肪酸的合成基因ACC、ME、SREBP-1的表達(dá)，可能是因?yàn)殡S著賴氨酸的增加，大部分的能量會轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，使得脂肪合成減少[27]。

3.3 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)與腹脂率的相關(guān)分析 本研究表明，日糧賴氨酸缺乏及其導(dǎo)致氨基酸不平衡時，會引起肉雞生長發(fā)育、腹脂沉積顯著下降。本研究結(jié)果表明，肝臟FABP1基因的mRNA表達(dá)與肉雞的腹部脂肪率顯著正相關(guān)，這與蔣瑞瑞等[28]的研究結(jié)果一致。此外，ACC基因在肝臟中的mRNA表達(dá)水平與肝臟ME和SREBP-1基因呈正相關(guān)，這與Tang等[29]的研究結(jié)果一致。FABP1和ACC都是促進(jìn)脂肪合成的關(guān)鍵基因。本試驗(yàn)研究表明，賴氨酸過量時，ME表達(dá)量顯著下調(diào)，腹脂率也減少。Grisoni等[26]研究結(jié)果一致，即ME活性與腹脂沉積同步變化。

4 結(jié) 論

本研究初步揭示日糧賴氨酸缺乏或過量及其導(dǎo)致的氨基酸不平衡主要是通過下調(diào)肝臟脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，而降低肉雞的生長發(fā)育及脂肪沉積。