硫酸銨提高裂殖壺菌不飽和脂肪酸積累的代謝組學(xué)研究

陳勝蘭 趙曉艷 任路靜 紀(jì)曉俊 黃和

摘要：采用基于氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，通過分析裂殖壺菌胞內(nèi)代謝物的變化，研究（NH4）2SO4提高裂殖壺菌不飽和脂肪酸積累的作用機(jī)制。利用GCMS技術(shù)對添加0，1.5，2.5和3.5 g/L （NH4）2SO4的發(fā)酵樣品進(jìn)行分析，結(jié)合KMeans 算法對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到胞內(nèi)代謝物的熱圖。主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（OPLSDA）得分圖可將不同添加條件下裂殖壺菌胞內(nèi)物質(zhì)明顯區(qū)分。運用PLSDA載荷圖及模型的變量重要性因子（VIP）值，發(fā)現(xiàn)了7種代謝物可作為區(qū)別4種不同條件下的生物標(biāo)志物。經(jīng)NIST和Wiley譜庫檢索，它們分別為葡萄糖、肌醇、甘露醇、果糖、磷酸、乙醇胺、乙胺。代謝途徑分析結(jié)果表明，（NH4）2SO4是通過弱化糖酵解途徑和乙酸合成支路，提高蘋果酸酶的活力，強(qiáng)化氨基酸代謝和NADPH的積累，從而提高不飽和脂肪酸積累。

關(guān)鍵詞 ：裂殖壺菌； 代謝組學(xué)； 主成分分析； 硫酸銨； 二十二碳六烯酸

1 引 言

代謝組學(xué)是對在某一特定生理時期內(nèi)生物樣品中的所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行無偏定性和定量分析的一門學(xué)科，通過檢測代謝物水平在某種刺激下所產(chǎn)生的整體變化（量變以及質(zhì)變），鑒定出目標(biāo)差異代謝物[1～3]，具有分離效率高、靈敏度高、可選擇性地分離檢測大量代謝物和同分異構(gòu)體等優(yōu)點而被廣泛關(guān)注。

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，C22∶6，簡稱DHA）是一種重要的ω3長鏈多不飽和脂肪酸[4]，是神經(jīng)細(xì)胞生長及維持的重要元素，在預(yù)防和治療心血管疾病、防治動脈硬化等方面具有顯著功效[5，6]。而裂殖壺菌具有生長速度快、易培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組分簡單和DHA含量高等優(yōu)勢，是通過發(fā)酵生產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌種。

有研究發(fā)現(xiàn)[7]，通過補加（NH4）2SO4的方式，可以緩解由氮源消耗所引起的DHA含量降低，最終DHA含量達(dá)到44.7%，比未添加（NH4）2SO4時提高34.6%。同時，在未添加（NH4）2SO4時，裂殖壺菌油脂中不皂化物的含量高達(dá)264.78 mg/g，是正常情況的1.8倍，嚴(yán)重影響了油脂的品質(zhì)[8]。另外，Ling等[9]報道，在DHA發(fā)酵中同時補加谷氨酸鈉，可使DHA的含量達(dá)到24.74 g/L，比不添加時提高了65.9%。上述研究僅從宏觀上發(fā)現(xiàn)了氮源在DHA發(fā)酵中的顯著作用，但氮源促使多不飽和脂肪酸積累的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究利用基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS） 技術(shù)的代謝組學(xué)方法，分析裂殖壺菌Schizochyrium sp. HX308在添加不同濃度（NH4）2SO4條件下胞內(nèi)代謝物的變化特征，尋找其潛在的代謝差異標(biāo)志物，獲得代謝物變化與發(fā)酵性能參數(shù)的相互關(guān)系，探討（NH4）2SO4促使DHA高效積累的可能機(jī)理。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Trace GC2000 DSQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；MD2001氮氣濃縮儀（杭州奧盛公司）； GC2010氣相色譜儀（日本Shimadzu公司）；SBA40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）； 3K15高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）。

甲醇（HPLC級，山東禹王實業(yè)有限公司）；吡啶（色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；N甲基N（三甲基硅氧烷基）三氟乙酰胺（NMethylNtrimethylsilyl trifluoracetamide，MSTFA），甲氧胺鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；培養(yǎng)基組成物質(zhì)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；核糖醇（≥99%，Sigma公司）；實驗用水為某品牌純凈水。

2.2 菌種與培養(yǎng)方法

裂殖壺菌（Schizochytrium sp.HX308） CCTCC M209059，由本實驗室自主篩選獲得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。種子、發(fā)酵培養(yǎng)基組分參考文獻(xiàn)[10]，發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度為60 g/L，接種量為10%，過程中第一次補糖時同時添加不同濃度（1.5， 2.5和3.5 g/L）（NH4）2SO4，培養(yǎng)條件為30℃，170 r/min。

2.3 發(fā)酵表觀數(shù)據(jù)分析

葡萄糖濃度和細(xì)胞干重的測定見參照文獻(xiàn)[11]，蘋果酸酶的測定見參照文獻(xiàn)[12]。

脂質(zhì)提?。喝?00 mL發(fā)酵液在50℃預(yù)熱，用NaOH調(diào)至pH 10～12，按3‰（w/V）的比例加破壁酶，50℃下攪拌并保溫2 h；按發(fā)酵液酒精正己烷（1∶1∶1， V/V）的比例添加有機(jī)溶劑萃取，攪拌后靜置分層，收集正己烷相，萃取2～3次，旋轉(zhuǎn)蒸干，并烘干至恒重。

脂肪酸甲酯化： 取0.1 g干菌體，加入3 mL 0.5 mol/L KOH甲醇溶液，65℃水浴17 min，冷卻；再加入2 mL BF3乙醚甲醇溶液（3∶7， V/V），65℃水浴7 min，冷卻；加2 mL飽和NaCl溶液、3 mL正己烷，充分振蕩萃取，取萃取液用作DHA分析。

GC分析條件：DB23色譜柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm， 美國Agilent公司）； 載氣： 氮氣； 分流比： 10∶1；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：280℃；進(jìn)樣量：1μL；程序升溫：初始柱溫100℃，先以25℃/min升至200℃，再以2℃/min升至220℃，保持12 min。柱流速：3.0 mL/min； 尾吹流速： 30 mL/min； 氫氣流速： 40 mL/min； 空氣流速： 400 mL/min。

GC/MS條件：DB5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，美國 Agilent公司）；載氣：氦氣，采用橫流模式，流速1 mL/min（恒流）分流進(jìn)樣，分流比1∶1；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度：250℃；梯度升溫程序：初始溫度70℃，保持2 min，以5℃/min升至300℃，保持3 min；傳輸線溫度：280℃；電子轟擊模式，EI源70 eV，離子源溫度 230℃；四極桿質(zhì)量分析器溫度：150℃；掃描質(zhì)量范圍m/z 50～600。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用AMDIS 軟件（NIST，v2.69，Gaithersburg，MD，USA）和MSD Chemstation軟件（Agilent Technologies，G1701 EA E.02.00.493，USA）對總離子色譜圖進(jìn)行質(zhì)譜峰的定性和定量分析，獲得代謝物的相對含量（與內(nèi)標(biāo)峰的比值）。然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Expander（version 6.0）軟件， 對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以熱圖表示。最后使用SIMCAP（version 11.0）進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（xOPLSDA），通過載荷圖、t檢驗和模型的變量重要性因子（Variable importance factor，VIP） 找出裂殖壺菌在添加不同濃度（NH4）2SO4下差異顯著的代謝物。

3 結(jié)果與討論

3.1 （NH4）2SO4對細(xì)胞生長及DHA積累的影響

葡萄糖和谷氨酸鈉是裂殖壺菌生長所需要的重要碳源和氮源，可作為衡量細(xì)胞生理活性的重要指標(biāo)。如圖1所示，添加（NH4）2SO4后， 葡萄糖和谷氨酸鈉的消耗速率明顯變慢，發(fā)酵周期明顯延長，添加3.5 g/L （NH4）2SO4時，發(fā)酵周期延長至84 h；細(xì)胞生長和總油脂的積累也受到抑制，其中油脂的含量由12.67 g/L分別降至5.83， 4.75和4.53 g/L；而油脂占細(xì)胞干重的百分含量則保持穩(wěn)定。在對照實驗中，39 h時， DHA含量由初始的51.22%降至41.83%，而添加（NH4）2SO4時，DHA含量并未降低反而增加，當(dāng)添加1.5 g/L（NH4）2SO4后，39 h時，DHA含量可達(dá)到52.63%，比未添加（NH4）2SO4時提高了25.82%。

3.2 裂殖壺菌代謝輪廓差異的分析

利用GC/MS對添加不同濃度（NH4）2SO4條件下胞內(nèi)代謝物進(jìn)行檢測，共檢出代謝物80多種。其中，4種條件下共有的代謝物主要包括氨基酸類、醇類、有機(jī)酸類、糖類、脂肪酸類等物質(zhì)（圖2）。添加（NH4）2SO4后， 甘油醛3磷酸、乙酸、蘋果酸、α酮戊二酸、富馬酸、磷酸、乙醇胺、肌醇等物質(zhì)代謝明顯比較活躍。其中，添加1.5和2.5 g/L （NH4）2SO4后，發(fā)酵至39 h時，丙氨酸、焦谷氨酸、4氨基丁酸、甘氨酸、半胱氨酸和纈氨酸的含量較高，說明此時氮代謝活力旺盛[13]，氨基酸是碳、氮代謝所必需的物質(zhì)，同時也是合成細(xì)胞組分蛋白質(zhì)的必要前體。氨基酸含量增加的同時可增加細(xì)胞內(nèi)因環(huán)境擾動而形成的異常蛋白的降解，從而合成更多有利蛋白以維持細(xì)胞在不良營養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞生理功能[14]。

3.3 潛在生物標(biāo)記物的分析

利用PCA分析添加（NH4）2SO4前后的多維數(shù)據(jù)，從得分圖（圖3A）發(fā)現(xiàn)，圖中4組數(shù)據(jù)均可以明顯區(qū)別開，尤其是補加1.5 g/L （NH4）2SO4時，與對照組存在顯著差異。圖3B為PCA載荷圖，圖中每個點代表胞內(nèi)一個代謝物變量，離原點較遠(yuǎn)的點為潛在的生物標(biāo)志物。圖4為VIP圖， VIP 因子可以用來反映代謝物對DHA積累的貢獻(xiàn)。在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，VIP>1，說明這些代謝物在DHA 積累過程中發(fā)揮重要作用（虛線以上）。以DHA占總脂肪酸的百分含量為目標(biāo)作VIP圖，結(jié)合PCA的載荷圖，最終確定與DHA含量密切相關(guān)的關(guān)鍵代謝物為葡萄糖、肌醇、甘露醇、果糖、磷酸、乙醇胺、乙胺，可作為區(qū)別4種不同條件下的生物標(biāo)志物，在各自代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵性的功能與作用。

3.4 關(guān)鍵代謝途徑的分析

為進(jìn)一步探究（NH4）2SO4調(diào)控不飽和脂肪酸合成的機(jī)制，針對熱圖、載荷圖和VIP圖獲得的關(guān)鍵代謝物進(jìn)行代謝途徑分析，圖5為裂殖壺菌胞內(nèi)合成DHA的主要代謝途徑[15]及添加不同濃度（NH4）2SO4 39 h后關(guān)鍵代謝物的濃度差異。

乙酸來源于丙酮酸，在添加（NH4）2SO4后，乙酸含量大大降低，尤其是添加2.5 g/L （NH4）2SO4 時，相比于對照降低了1/3，使代謝流更多地流向TCA循環(huán)。

蘋果酸酶是合成NADPH的關(guān)鍵酶，而蘋果酸是該合成反應(yīng)的底物也是該酶的激活劑[16]。添加（NH4）2SO4條件下的蘋果酸含量均高于不添加的條件，其中添加2.5 g/L （NH4）2SO4時蘋果酸含量是不添加條件下的5.43倍。如圖6所示，添加2.5 g/L （NH4）2SO4，39 h時蘋果酸酶的比活力可達(dá)410 U/mg，相比于對照組增加了26.06%。因此，添加（NH4）2SO4能夠增強(qiáng)蘋果酸酶的活性，從而產(chǎn)生較多脂肪酸合成必需的NADPH。而表1數(shù)據(jù)顯示，添加（NH4）2SO4后，不飽和脂肪酸含量提高，飽和脂肪酸含量降低，可能是脂肪酸合成途徑更易受（NH4）2SO4的影響，從而產(chǎn)生的NADPH主要供應(yīng)不飽和脂肪酸的合成。此外，據(jù)文獻(xiàn)[7]報道，（NH4）2SO4會對細(xì)胞造成一些毒害，從而誘使細(xì)胞膜組分發(fā)生變化，以抵抗不利環(huán)境，可能迫使細(xì)胞合成更多的不飽和脂肪酸以維持細(xì)胞生長。

α酮戊二酸、富馬酸是氮代謝途徑和TCA循環(huán)的核心物質(zhì)，NH+4經(jīng)谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶催化形成谷氨酸，谷氨酸是胞內(nèi)其它氨基酸生物合成的主要氨基供體，可形成各種有機(jī)氮化合物，最后合成各種蛋白質(zhì)或核酸[17]。細(xì)胞氮代謝有關(guān)酶活性直接受到培養(yǎng)基氮營養(yǎng)水平的影響，從而直接影響不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。添加（NH4）2SO4后，α酮戊二酸、富馬酸的含量均明顯升高，說明此時TCA循環(huán)中代謝流比較活躍。

H3PO4是一種重要的代謝物，不僅是細(xì)胞膜磷脂雙分子層的重要組成成分，還參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)[18]。在真菌中，磷酸化合物會改變磷脂雙分子層的組成，進(jìn)而改變細(xì)胞膜流動性[19]。同時。H3PO4還可以激活某些蛋白激酶，調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞對環(huán)境作出應(yīng)激反應(yīng)[20]。添加（NH4）2SO4后，H3PO4含量明顯升高，在細(xì)胞生長過程中，為不飽和脂肪酸的高效合成提供了有效的能量支持和信號傳遞作用。

肌醇是多元醇中的一種，可以作為碳水化合物的存儲體、轉(zhuǎn)運物質(zhì)、輔酶調(diào)節(jié)劑和還原力儲存物[21，22]，是微生物對環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中的一種相容性溶質(zhì)[23]，在補加（NH4）2SO4時，肌醇含量顯著升高，可能是為了抵御添加（NH4）2SO4帶來的酸性環(huán)境脅迫，細(xì)胞需要生成更多的肌醇以維護(hù)細(xì)胞功能。另一方面，肌醇在儲存還原力和輔酶調(diào)節(jié)上也有功效，添加（NH4）2SO4后，蘋果酸酶活性提高加速了NADPH的積累，因此需要更多的肌醇來儲存大量的還原力和乙酰輔酶A以供細(xì)胞合成多不飽和脂肪酸。

4 結(jié) 論

本研究利用基于 GCMS 的代謝組學(xué)方法研究了添加不同濃度（NH4）2SO4對裂殖壺菌胞內(nèi)代謝譜的變化。多元統(tǒng)計分析表明，添加不同濃度的（NH4）2SO4組代謝譜存在顯著差異，并篩選出7種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，分別為葡萄糖、肌醇、甘露醇、果糖、磷酸、乙醇胺、乙胺。結(jié)合代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)（NH4）2SO4可以弱化糖酵解途徑，減少乙酸的生成并加快氨基酸代謝，使代謝流更多的流向TCA循環(huán)；還可以提高胞內(nèi)蘋果酸酶的活力，促進(jìn)NADPH供應(yīng)量，從而提高裂殖壺菌胞內(nèi)不飽和脂肪酸的積累，對后期從細(xì)胞生理性狀角度出發(fā)進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控具有指導(dǎo)意義。

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Abstract A metabonomics method based on gas chromatographymass spectrometry （GCMS） was established to analyze the changes of intracellular metabolites and study the mechanism of ammonium sulfate enhancing unsaturated fatty acids accumulation in Schizochytrium sp. Metabolites of cells cultivated at 0， 1.5， 2.5 and 3.5 g/L （NH4）2SO4 were analyzed at different times. Heat map was obtained with KMeans algorithm for data clustering analysis. Principal component analysis （PCA） and partial leastsquares discrimination analysis （OPLSDA） were employed for pattern recognition， and an obvious distinction among different conditions was achieved. According to the LSDA load diagram and variable important factor （VIP） value， 7 biomarkers were determined with significant differences between four different conditions， which were identified as glucose， inositol， mannitol， fructose， phosphoric acid， ethylamine and ethanolamine by searching in NIST and Wiley database. Metabolic pathway analysis indicated that the metabolic flux toward the EmbdenMeyerh ofParnas （EMP） pathway and acetic acid synthesis branch were weakened by ammonium sulfate. Meanwhile， malic enzyme activity increased and the accumulation of NADPH was also enhanced. These might be the reason for the improvement of polyunsaturated fatty acids.

Keywords Schizochytrium sp； Metabonomics； Principal component analysis； Ammonium sulfate； Docosahexaenoic acid