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    人類白細胞抗原基因HLA—B58∶01基因型的快速低成本鑒別方法

    2016-10-21 16:13初亞男張婕妤封利穎周國華
    分析化學 2016年5期
    關鍵詞:等位基因位點基因型

    初亞男 張婕妤 封利穎 周國華

    摘要:采用焦磷酸測序技術和改進的全血基因組提取方法,建立了位于6號染色體的銀屑病易感基因1候選基因1(Psoriasis susceptibility 1 candidate 1,PSORS1C1)rs9263726位點的焦磷酸測序方法,檢出限達到0.4 ng/μL基因組DNA,20例標本的焦磷酸法和Sanger法測序結果完全一致。利用本方法對683例標本的rs9263726位點進行測序,得到中國人群該位點野生型(GG型)分布頻率為87.6%,突變的GA型分布頻率為11.7%、AA型分布頻率為0.7%。通過對隨機選取的46例標本rs9263726位點與人類白細胞抗原基因HLAB*58∶01基因型的連鎖關系進行分析,結果表明,該位點預測HLAB*58∶01基因型的靈敏度為100%、特異性為91.3%。本方法可用于HLAB*58∶01基因型的檢測。

    關鍵詞 :人類白細胞抗原基因HLAB*58∶01; 焦磷酸測序; rs9263726位點; 基因型

    1 引 言

    別嘌呤醇被廣泛應用于臨床高尿酸血癥的常規(guī)治療,但是其皮膚型不良反應在用藥前無法預知,特別需要注意的是,發(fā)生不良反應的人群中約有1%~5%為StevensJohnson綜合征(SJS,皮膚脫落小于體表面積的10%,死亡率為1%~5%),20%~30%為中毒性表皮壞死松解征(TEN,皮膚脫落大于體表面積30%, 死亡率25%~35%)[1,2],急劇增加了患者的死亡風險。2005年, Hung等[3]發(fā)現(xiàn),由于別嘌呤醇引發(fā)SJS/TEN的51位中國漢族人,全部含有人白細胞抗原基因HLAB*58∶01;2009年,Tassaneeyakul等對泰國人別嘌呤醇致敏的分析發(fā)現(xiàn),HLAB*58∶01等位基因預測別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏的靈敏度(含有HLAB*58∶01等位基因的標本正確判定此標本會發(fā)生別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏反應的比例)為100%,特異性(不含有HLAB*58∶01等位基因的標本正確判定此標本不會發(fā)生別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏反應的比例)為87%[4]。據(jù)最新dbMHC等位基因頻率數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,HLAB*58∶01等位基因的攜帶頻率歐洲為0.77%,北美洲為0.38%,大洋洲為2.5%,東北亞為6.1%,在世界不同地區(qū)人群中的攜帶頻率有顯著的差異。2010年國際組織相容性工作組報道華人攜帶率平均為8.8%~10.9%,遠高于東北亞分布水平,因此中國漢族人群屬于別嘌呤醇引發(fā)SJS/TEN的高風險群體。

    HLA目前的分型方法主要有3類:血清學、細胞學和分子生物學分型法。其中血清學和細胞學分型法,由于高特異性的抗體和特異的細胞獲取困難,且操作繁瑣,因此目前很少使用。分子生物學分型方法主要有聚合酶鏈反應等位基因組特異性引物(PCRSSP)[5]、多聚酶鏈反應序列特異寡核苷酸探針(PCRSSOP)[6]、聚合酶反應直接測序法(PCRSBT)[7]。前兩種方法屬于低分辨HLA分型方法,容易產(chǎn)生假陽性;PCRSBT可以直接對HLA基因型的序列進行測定,分辨率高,能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因,但是由于雜合子的存在,需將同源染色體分離后才能得到各個單元型的準確結果,增加了操作的復雜性,檢測成本也相應增高[8]。

    2013年,Tohkin等[9]對日本14個別嘌呤醇誘發(fā)的SJS/TEN過敏人和991個正常健康人的全基因組關聯(lián)研究分析表明,位于6號染色體的銀屑病易感基因1候選基因1(Psoriasis Susceptibility1 Candidate1,PSORS1C1)上的rs9263726位點,存在G>A的多態(tài)性改變,該位點突變型A與HLAB*58∶01存在完全的等位基因關聯(lián)。因此,如能證實中國漢族人群存在同樣的等位基因關聯(lián),采用rs9263726位點代替HLA基因直接測序,進行別嘌呤醇用藥前HLAB*58∶01高致敏基因型的篩查,可以有效降低SJS/TEN致死性皮膚性過敏發(fā)生的風險并節(jié)約成本。

    焦磷酸測序技術具有操作簡便、靈敏度高、無需熒光標記等技術優(yōu)勢[10~12],本研究選用焦磷酸測序技術建立了rs9263726位點的多態(tài)性分析方法。隨機選擇了683例庫存核酸標本,進行了rs9263726位點多態(tài)性分型,首次得到中國人群該位點的基因頻率。同時,對46例標本進行了HLAB基因的PCRSBT直接測序和rs9263726位點多態(tài)性分析,對兩種方法的結果進行了比較。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Q24焦磷酸測序儀(德國Qiagen公司);A200基因擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司);微量紫外分光光度計(南京伍義科技有限公司);VORTEXGENIE 2渦漩混勻器(美國Scientific Industries基因公司);Legand Micro 21R冷凍離心機(美國Thermo公司),BG200恒溫混勻儀(杭州朗基科學儀器有限公司)。

    PCR擴增體系試劑盒(日本Takara公司);全血基因組提取試劑盒(美國Promega公司);焦磷酸測序試劑盒及退火和結合緩沖液(德國Qiagen公司);其它試劑均為分析純;實驗用水為滅菌蒸餾水。

    所有引物由上海Invitrogen公司合成,具體引物名稱及序列見表1。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 改進的基因組DNA提取方法 本研究采用經(jīng)過改進的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取法,提取基因組核酸,具體步驟如下:首先將175 μL抗凝全血和450 μL Cell Lysis Solution 混合,室溫放置6 min,13000 g離心20 s,棄上清液,保留底部沉淀和約20 μL上清液,渦旋至底部沉淀均勻分散至上清液中;加入180 μL Nuclei Lysis溶液,用移液器吹打混合均勻,36 ℃孵育5 min;降至室溫后加入70 μL Protein Precipitation溶液,渦旋振蕩30 s,13000 g離心5 min;上清液轉管至300 μL異丙醇中,沉淀核酸,13000 g離心1 min;棄上清液后加入200 μL 70%乙醇洗滌沉淀,除去乙醇后晾干沉淀,加入80 μL DNA Rehydration Solution即得到基因組DNA溶液。

    2.2.3 焦磷酸測序引物設計 擴增引物使用Primer 5.0軟件進行設計,測序引物使用Qiagen公司的Assay Design Software 2.0軟件設計。

    2.2.4 PCR擴增 PCR反應體系體積為50 μL,包括dNTP 200 μmol/L,10×PCR Buffer 5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,Taq酶1.25 U,上下游引物0.4 μmol/L,基因組DNA 2.5 μL。PCR反應條件:94℃,5 min;94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,30 s;35個循環(huán);72 ℃,7 min。

    2.2.5 焦磷酸測序 取20 μL PCR擴增產(chǎn)物和2 μL親和素修飾的微球,與18 μL蒸餾水、40 μL結合緩沖液混合,振蕩孵育7 min,使用單鏈制備模塊制備測序需要的單鏈,加入含有10 μmol/L測序引物和24 μL退火緩沖液的24孔板中,85 ℃解鏈1 min,室溫退火,放入焦磷酸測序儀中固定。設置測序推注順序為“CAAGGT”,其中“C”為rs9263726位點前的一個參比堿基,同理堿基“T”為其后的參比堿基,第一個“A”為rs9263726位點的突變型信號峰,第二個“A”可獲知A堿基的測序本底,同理G堿基為野生型信號峰。在焦磷酸測序儀的試劑倉中依次加入4種堿基A、C、G、T,測序底物(S)和酶(E),運行程序10 min后得到相應測序圖譜。

    3 結果與討論

    3.1 改進的基因組DNA提取方法

    通過降低抗凝全血用量、縮短離心和孵育時間等步驟,對Wizard Genomic DNA Purification Kit法進行了改進,改進后僅需175 μL DETA抗凝全血就可以得到大于3 μg的基因組核酸,所需血量比原有方法減少了40%,提取時間減少了30%。得到基因組DNA濃度范圍在50~100 ng/μL,A260/A280為1.8~2.0,能滿足后續(xù)焦磷酸測序的需要。

    3.2 基因組DNA樣本濃度對焦磷酸測序檢測rs9263726位點的影響

    設置3個濃度分別為10.0,2.0和0.4 ng/μL以及空白的人基因組DNA樣品,考察建立的rs9263726位點測序方法,選擇A260/A280比值在1.8~2.0之間、初始濃度約為50 ng/μL的人基因組DNA用蒸餾水進行梯度稀釋。每個梯度平行擴增3管,以焦磷酸測序是否獲得預期的信號峰來評判本方法中基因組DNA濃度對rs9263726位點的影響,結果如圖1所示,圖中灰色區(qū)域為SNP的判別區(qū)域,第一個“A”出現(xiàn)信號峰代表突變型信號,“G”出現(xiàn)信號峰代表野生型信號,可見本方法可檢測濃度低至0.4 ng/μL的人基因組DNA模板樣品。

    3.3 焦磷酸測序檢測rs9263726位點的準確率

    選擇20例庫存人基因組DNA標本,每個標本平行擴增2份,一份用焦磷酸測序方法進行檢測,一份用Sanger測序方法檢測,檢測結果見表2,焦磷酸測序方法對rs9263726位點測序結果準確率為100%。

    3.4 rs9263726位點在中國人群中基因分布頻率

    目前,還未見中國人群中rs9263726位點基因分布頻率的相關文獻報道,因此研究該位點在中國人群中的分布頻率十分必要。本研究選擇2013年7月~2014年7月期間本實驗室核酸標本庫中的683例人基因組核酸標本,進行rs9263726位點的測序分析,683例標本檢出野生純合型(GG型)標本598例,突變雜合型(GA型)標本80例,突變純合型(AA型)標本5例。上述結果表明,rs9263726位點野生型分布頻率為87.6%,突變雜合型分布頻率為11.7%,突變純合型分布頻率為0.7%,突變型的總分布頻率為12.4%。

    3.5 rs9263726位點表征HLAB*58∶01基因型的特異性評價

    雖然日本的研究者已經(jīng)評價了日本人群中rs9263726位點與HLAB*58∶01基因型存在完全的等位基因關聯(lián),但是還未見表征該位點在中國人群中是否也具有類似的關聯(lián)關系的報道,所以本研究隨機選擇了21例rs9263726位點檢測結果為野生型、25例檢測結果為突變型的標本送華大基因采用PCRSBT的方法進行HLAB分型。46例隨機選擇的標本驗證結果表明,rs9263726位點表征HLAB*58∶01基因型的靈敏度(采用焦磷酸測序檢測rs9263726位點正確判定檢測標本含有HLAB*58∶01基因型的比例)達到100%,特異性(采用焦磷酸測序檢測rs9263726位點正確判定檢測標本不含有HLAB*58∶01基因型的比例)為91.3%。

    4 結 論

    rs9263726位點存在G>A的多態(tài)性改變,本研究結果表明,在中國人群中該位點突變型A與HLAB*58∶01基因型存在緊密的連鎖關系,通過采用焦磷酸測序方法測定rs9263726位點的基因型,可以間接確定被檢測對象是否攜帶有HLAB*58∶01基因型,與直接采用PCRSBT法對HLAB進行分型相比,可有效降低檢測成本,節(jié)約檢測時間,且無需專業(yè)的分型軟件[11]。本研究表明,rs9263726位點對HLAB*58∶01基因型的檢出靈敏度高達100%,特異性也達到了91.3%。這與文獻[13]采用ILLumina公司的芯片對rs9262570位點檢測HLAB*58∶01基因型得到的結果相近。Cao等[14]對572例中國漢族人的研究結果表明,HLAB*58∶01基因型分布頻率為13.99%,這與本研究中rs9263726位點突變型的分布頻率12.4%非常接近。

    采用焦磷酸測序檢測rs9263726位點的基因型代替現(xiàn)有PCRSBT法對HLAB*58∶01的檢測可節(jié)約檢測時間,降低患者就醫(yī)成本,避免由于攜帶HLAB*58∶01基因型而引發(fā)的高致死性SJS/TEN綜合征的發(fā)生,具有非常廣泛的臨床應用價值。

    References

    1 Pavlos R, Mallal S, Phillips E. Pharmacogenomics, 2012, 13(11): 1285-1306

    2 Kaniwa N, Saito Y. J. Hum. Genet., 2013, 58(6): 317-326

    3 Hung S I, Chung W H, Liou L B, Chu C C, Lin M, Huang H P, Lin Y L, Lan J L, Yang L C, Hong H S. P. Natl. Acad. Sci. USA., 2005, 102(11): 4134-4139

    4 Tassaneeyakul W, Jantararoungtong T, Chen P, Lin P Y, Tiamkao S, Khunarkornsiri U, Chucherd P, Konyoung P, Vannaprasaht S, Choonhakarn C. Pharmacogenet. Genom., 2009, 19(9): 704-709

    5 Bunce M, Procter J, Welsh K. Tissue Antigens, 1999, 53(5): 498-506

    6 Ng J, Nurlay C K, Baxterowe L A, Chepak M, Cappe P A, Hagland J, KaKuraya D, Manes D, Rosner G, Schmeckpaper B. Tissue Antigens, 1993, 42(5): 473-4797 Metzker M L. Genome. Res., 2005, 15(12): 1767-1776

    8 XING XiaoQing, CHU YaNan, XIANG Zheng, SONG QinXin, ZHOU GuoHua. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(11): 1574-1579

    邢曉清, 初亞男, 項 錚, 宋沁馨, 周國華. 分析化學, 2014, 42(11): 1574-1579

    9 Tohkin M, Kaniwa N, Saito Y, Sugiyama E, Kurose K, Nishikawa J, Hasegawa R, Aihara M, Matsunaga K, Abe M, Furuya H, Takahashi Y, Ikeda H,Muramatsu M, Ueta M, Sotozono C, Kinoshita S, Ikezawa Z. Pharmacogenomics J., 2013, 13(1): 60-69

    10 YE Hui, LIU YunLong, ZOU BingJie, WU HaiPing, ZHOU GuoHua. Chinese J. Anal. Chem., 2013, 41(5): 744-748

    葉 卉, 劉云龍, 鄒秉杰, 武海萍, 周國華. 分析化學, 2013, 41(5): 744-748

    11 XIANG Zheng, LIU YunLong, XING XiaoQing, CHU YaNan, ZHOU GuoHua. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(1): 55-62

    項 錚, 劉云龍, 邢曉清, 初亞男, 宋沁馨, 周國華. 分析化學, 2015, 43(1): 55-62

    12 SONG QinXin, LIU YunLong, ZHOU GuoHua. Journal of China Pharmaceutical University, 2011, 42(6): 481-489

    宋沁馨, 劉云龍, 周國華. 中國藥科大學學報, 2011, 42(6): 481-489

    13 Liu X, Sun J, Yu H, Chen H, Wang J, Zou H, Lu D, Xu J, Zheng S L. Pharmacogenomics J., 2015, 15(5): 467-472

    14 Cao Z H, Wei Z Y, Zhu Q Y, Zhang J Y, Yang L, Qin S Y, Shao L Y, Zhang Y T, Xuan J K, Li Q L, Xu J H, Xu F, Ma L, Huang H Y, Xing Q H, Luo X Q. Pharmacogenomics, 2012, 13(10): 1193-1201

    Abstract A new method for polymorphism detection of rs9263726 site on Psoriasis Susceptibility1 Candidate1(PSORS1C1) was established based on the pyrosequencing technology and the improved method of genomic DNA extraction from whole blood. The detection limit of the method was 0.4 ng/μL genomic DNA. A total of 20 samples were detected by pyrosequencing, and the results were consistent with those of Sanger sequencing. A total of 683 clinical samples were analyzed with pyrosequencing method. The polymorphism distribution of rs9263726 in Chinese populations was summarized as GG (87.6%), GA (11.7%) and AA (0.7%). 46 clinical samples were detected to analyze the relationship between rs9263726 genotype and human leukocyte antigen gene HLAB*58∶01 genotype. The results showed that the genotype of HLAB*58∶01 could be predicted by polymorphism detection of rs9263726 site sequence. The sensitivity of the proposed method was 100%, and the specificity was 91.3%. This study demonstrated a new method for HLAB*58∶01 genotyping.

    Keywords Human leukocyte antigen gene HLAB*58∶01; Pyrosequencing; Rs9263726 site; Genotype

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