疏血通注射液對(duì)急性心肌梗死大鼠組織miRNA-126表達(dá)水平的影響

楊洋，徐萍，李潞，杜秋紅，東洋，侯平

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110002；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科）

疏血通注射液對(duì)急性心肌梗死大鼠組織miRNA-126表達(dá)水平的影響

楊洋1，徐萍1，李潞1，杜秋紅1，東洋1，侯平2?

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110002；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科）

目的：觀察急性心肌梗死后大鼠心肌組織miRNA-126表達(dá)水平的變化趨勢(shì)以及疏血通注射液對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織miRNA-126表達(dá)水平的影響。方法：選取SD大鼠80只，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，建立心肌梗死模型，存活60只，隨機(jī)分為疏血通組及模型組，另隨機(jī)選取30只大鼠作為對(duì)照組。建模成功后，疏血通組給予疏血通注射液治療，模型組及假手術(shù)組予以等量生理鹽水，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)術(shù)后不同時(shí)間大鼠心肌組織miRNA-126的表達(dá)水平變化。結(jié)果：術(shù)后第7天和第14天，疏血通組及模型組大鼠心肌組織miRNA-126表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05），但2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后第14天，疏血通組心肌組織miRNA-126表達(dá)水平較前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：miRNA-126在大鼠心肌梗死后7 d顯著降低；隨著時(shí)間的推移，miRNA-126表達(dá)水平逐漸升高；疏血通能夠上調(diào)miRNA-126的表達(dá)水平。

疏血通；miRNA-126；大鼠；急性心肌梗死

［Abstract］Objective：To observe expression level change of miRNA-126 in the myocardial tissue of rats with myocardial infarction and to observe the influence of Shuxuetong injection.Methods：Myocardial infarction model was established in 80 SD rats，60 survival rats were randomly divided into Shuxuetong group and model group，the other 30 rats were randomly selected as control group.After the success of the modeling，Shuxuetong group received Shuxuetong injection treatment，model group and control group received same amount of normal saline.Real-time quantitative PCR was used to detect miRNA-126 expression levels in rat myocardial tissue at diferent time after operation.Results：After 7 days and 14 days，miRNA-126 expression levels in rats myocardial tissue in Shuxuetong group and model group were significantly lower than that in the control group（P＜0.05），but there was no difference between the two groups.After 14 days，miRNA-126 expression levels in the Shuxuetong group were higher than that after 7 days（P＜0.05）.Conclusions：miRNA-126 in 7 days after myocardial infarction significantly reduced.With the passing of time，miRNA-126 expression levels increased gradually and Shuxuetong can increase the expression levels of miRNA-126.

［Key words］Shuxuetong；miRNA-126；rats；acute myocardial infarction

急性心肌梗死（AMI）是指急性心肌缺血性壞死。據(jù)相關(guān)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，每年有超過(guò)300萬(wàn)人患急性ST段抬高型心肌梗死［1］，且數(shù)量正逐年上升。尋找敏感性及特異性高的標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。miRNA-126是一種內(nèi)皮特異性miRNA，在人體內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［2］。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取SD大鼠80只，普通級(jí)，雌雄不限，體重220～300 g，3月齡，建立AMI模型，存活60只，隨機(jī)分為疏血通組及模型組，另隨機(jī)選取30只大鼠作為對(duì)照組。

1.2儀器與設(shè)備 稱重儀：香山衡器（武漢市）有限公司；氣管插管、醫(yī)用輸液器：Eppendorf公司；離心機(jī)（3K40）：湘潭離心機(jī)有限公司；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽：日立高新技術(shù)（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1建立大鼠AMI模型（1）大鼠稱重后用2%戊巴比妥鈉按60 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉；（2）將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，按順序連接心電圖各個(gè)導(dǎo)聯(lián)，描記體表心電圖；（3）經(jīng)口氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，給予機(jī)械通氣（呼吸比率 1∶1，頻率65次/min，潮氣量8 ml）；（4）開(kāi)胸暴露出大鼠心臟，分離心包，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的前降支，建立AMI模型；（5）然后觀察結(jié)扎部位心肌顏色的變化，如果顏色變白說(shuō)明模型建立成功，同時(shí)可見(jiàn)心電圖ST-T段明顯抬高，此時(shí)記錄心電圖，關(guān)閉胸腔，縫合頸部皮膚，（6）各組大鼠在術(shù)前30 min和術(shù)后3 d連續(xù)肌注2.0×105U青霉素預(yù)防感染。

1.3.2大鼠建模后處理 建模成功后，疏血通組于造模后6 h按0.25 ml/kg給予疏血通注射液治療，每天1次，連續(xù)用藥14 d；模型組及對(duì)照組予以等量生理鹽水，均于造模后6 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入，每天1次，連續(xù)用藥14 d。

1.3.3制備病理標(biāo)本 于術(shù)后第7天3組各隨機(jī)抽取15只大鼠用斷頭法處死，（3組各剩余15只于術(shù)后第14天斷頭處死），處死后開(kāi)胸取出心臟，分離出左心室，心肌組織變?yōu)榛野咨膮^(qū)域即為梗死灶，取少量梗死組織，用 10%甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋，制成4 μm切片，進(jìn)行HE染色。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-126的表達(dá) 采用Trizol試劑提取心臟組織標(biāo)本的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），以此為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。使用Transgene公司提供的方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-126基因表達(dá)水平，以 U6基因作為內(nèi)參。擴(kuò)增 miR-126基因的上游引物：5＇-GGCATTACGTTTGGTACGCGAAA-3'；擴(kuò)增U6基因上游引物：5'-CTCGCTTCAGCAGCACA-3'，反向引物皆為Takara提供的通用引物。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為70 bp和75 bp。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，ΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AMI模型建立成功 大鼠體表心電圖I、aVL等導(dǎo)聯(lián)ST段呈弓背向上抬高，并且持續(xù)時(shí)間達(dá)30 min以上。術(shù)后對(duì)心電圖進(jìn)行對(duì)比觀察，能夠觀察到心肌梗死后心電圖ST-T的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，見(jiàn)圖1。

圖1　大鼠AMI心電圖動(dòng)態(tài)演變過(guò)程

2.2心肌病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 病理學(xué)染色可見(jiàn)心肌梗死組織變?yōu)榛野咨?，?jiàn)圖2。

圖2　心肌病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，疏血通組心肌細(xì)胞排列有序，只有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維化相對(duì)模型組輕；模型組心肌組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維化嚴(yán)重，與假手術(shù)組相比，大量正常的心肌組織被纖維組織代替，假手術(shù)組為正常心肌，見(jiàn)圖3。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 術(shù)后第7天，疏血通組大鼠及模型組大鼠心肌組織miRNA-126的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05）。術(shù)后第14天，疏血通組miRNA-126的表達(dá)水平較前明顯升高（P＜0.05），模型組較前升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2組與假手術(shù)組比較，仍低于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　3組大鼠心肌組織miR-126表達(dá)水平比較

圖3　心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果（×200）

3　討論

miRNA-126是一類高度保守的 miRNA，其定位點(diǎn)為Egfl7基因的第7內(nèi)含子［3］，具有內(nèi)皮特異性，因此它在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，參與炎癥、介導(dǎo)血小板遷移等多種過(guò)程，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要調(diào)控作用［4］。疏血通注射液是水蛭和地龍經(jīng)低溫提取、膜分離等技術(shù)精制而成，其主要成分為水蛭素樣物質(zhì)和蚓激酶樣物質(zhì)。水蛭素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，水蛭中還含有組胺樣物質(zhì)，入血后能迅速緩解血管痙攣，增加缺血組織的血供，緩解組織缺血缺氧的癥狀［5］。蚓激酶是一種纖溶酶原激活劑，具有抑制血栓形成、改善微循環(huán)和溶解血栓等作用，且其具有不易出血的優(yōu)點(diǎn)［6］，已被廣泛應(yīng)用于AMI的治療中。本研究通過(guò)檢測(cè)AMI大鼠梗死心肌組織的miRNA-126表達(dá)水平變化及其隨時(shí)間的變化，探討miRNA-126與心肌梗死的關(guān)系，同時(shí)觀察疏血通對(duì)AMI心肌組織纖維化的改善情況以及其對(duì)miRNA-126表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后，心電圖ST段隨時(shí)間成動(dòng)態(tài)演變，處死大鼠后觀察大鼠心肌梗死組織變成灰白色，經(jīng)HE染色后，3組切片明顯不同，正常心肌細(xì)胞排列有序，僅有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞嚴(yán)重纖維化，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；疏血通組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂程度及纖維化程度較模型組輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)量較模型組低。提示疏血通注射液可改善心肌纖維化，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果提示，在大鼠心肌梗死后第7天，疏血通組及模型組心肌組織中的miRNA-126表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miRNA-126表達(dá)水平下調(diào)與急性心肌梗死有關(guān)。術(shù)后第14天，疏血通組及模型組大鼠心肌組織miRNA-126表達(dá)水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但疏血通組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)，這與李國(guó)達(dá)等［7］研究結(jié)果相似。

綜上所述，結(jié)合病理圖片及數(shù)據(jù)，本研究認(rèn)為，在大鼠AMI組織中，miRNA-126表達(dá)水平在梗死后第7天下降，隨著時(shí)間的推移，miRNA-126表達(dá)水平逐漸上調(diào)，miRNA-126具有保護(hù)血管內(nèi)皮、促進(jìn)血管再生等多重作用，疏血通注射液具有改善心肌纖維化及降低炎癥反應(yīng)等作用，其可促進(jìn)miRNA-126表達(dá)水平的上調(diào)，但只有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待大樣本研究。

［1］White HD，Chew DP.Acute myocardial infarction［J］.Lancet，2008，372（9638）：570-584.

［2］van Solingen C，Seghers L，Bijkerk R，et al.Antagomir-mediated silencing of endothelial cell specific microRNA-126 impairs ischemia-induced angiogenesis［J］.J Cell Mol Med，2009，13（8A）：1577-1585.

［3］Nagalla S，Shaw CK，Kong X，et al.Platelet microRNA-mRNA coexpression profiles correlate with platelet reactivity［J］.Blood，2011，117（19）：5189-5197.

［4］Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNase IIl Drosh ainitiates microRNA processing［J］.Nature，2003，425（6956），415-419.

［5］張璇，肖兵，胡長(zhǎng)林，等.疏血通注射液抗栓、溶栓作用機(jī)制的研究 ［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30（24）：1950-1952.

［6］郭宏杰，張憲生.疏血通注射液對(duì)凝血功能的影響 ［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（19）：2380-2382.

［7］李國(guó)達(dá)，劉衍宇，方凌燕，等.miR-126及VEGF在大鼠心肌梗死交界區(qū)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 ［J］.心臟雜志，2015，27（6）：639-644.

The Influence of Shuxuetong Injection on the Expression Levels of miRNA-126 in Myocardial Tissues of Rats with Acute Myocardial Infarction

YANG Yang1，XU Ping1，LI Lu1，DU Qiuhong1，DONG Yang1，HOU Ping2?
（1.Department of Cardiology，The Second Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110002，China；2.Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine）

R542.2

A

1008-2344（2016）03-0146-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.03.006

2016-02-28

（吳迪 編輯）

沈陽(yáng)市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（No.F14-182-1-00/F14-158-9-26）

侯平（1963—），女（漢），主任醫(yī)師，教授，研究方向：冠心病、心律失常、心衰.E-mail：houping57@yahoo.com.cn