七筋姑不同倍型的克隆構(gòu)型研究

劉昕，劉麗，趙亮，王祎玲

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000）

七筋姑不同倍型的克隆構(gòu)型研究

劉昕，劉麗，趙亮，王祎玲

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000）

七筋姑隸屬百合科七筋姑屬，多年生草本，具有二倍體和四倍體兩種細(xì)胞型，可通過根芽的方式進(jìn)行無性繁殖.本文采用SSR分子標(biāo)記對(duì)其克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明:二倍體種群與四倍體種群全為多克隆種群，沒有發(fā)現(xiàn)單克隆種群，克隆構(gòu)型均為混合型.兩種倍型152個(gè)七筋姑個(gè)體中出現(xiàn)了117個(gè)基因型，其中二倍體包含29.5個(gè)基因型，四倍體包含29個(gè)基因型，平均每個(gè)種群有29.25個(gè)克隆.物種水平上Simpson多樣性指數(shù)（D）為0.992，基因型比率（PD）為0.700，表現(xiàn)出克隆多樣性.二倍體克隆多樣性（D=0.978，PD=0.846）略高于四倍體（D=0.974，PD=0.805）.相關(guān)性表明環(huán)境因子與克隆多樣性無顯著相關(guān).多基因型起源、兼性有性生殖和實(shí)生幼苗的更新可能是七筋姑不同倍型基因型豐富的來源.

七筋姑；克隆結(jié)構(gòu)；細(xì)胞型

1　引言

繁殖是一切生物產(chǎn)生后代延續(xù)種族的最基本方式，它是種群形成、進(jìn)化的基礎(chǔ)，更是群落和生態(tài)系統(tǒng)演替的根本［1-2］.在自然條件下，大多數(shù)植物都具有兩種繁殖方式：無性繁殖和有性繁殖.無性繁殖是一種非常特殊的繁殖模式［3］，直接導(dǎo)致子代的基因與親本一致，這個(gè)模式對(duì)具有克隆繁殖的物種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)有很大的干擾［2］.克隆植物一個(gè)種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)不能通過對(duì)所有植株統(tǒng)計(jì)獲取，而是由基株數(shù)目所定，基株是一個(gè)種群內(nèi)由一個(gè)合子演化而來的有一致基因型植株的總稱，基株內(nèi)每個(gè)植株稱為分株，基株也被看作是一個(gè)遺傳獨(dú)立體.克隆構(gòu)型是克隆植物在進(jìn)化過程中形成的對(duì)環(huán)境異質(zhì)性的利用能力，具體指具有無性繁殖的植物種群內(nèi)基株和眾多分株在空間位置上的分布規(guī)律，分為密集型、游離型和一些中間類型的混合型.密集型，分株間距離很短；游離型，基株擴(kuò)散距離較大；混合型則是密集型和游離型鑲嵌構(gòu)成一種過渡的模式［4］.研究克隆構(gòu)型和多樣性能判斷物種的繁殖和進(jìn)化程度，種群的規(guī)模、走勢(shì)及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，可為保護(hù)物種多樣性提供理論依據(jù)［2，4-5］.

七筋姑（Clintonia udensis Trautv.et Mey.）是百合科（Liliaceae）黃精族（Polygonateae）七筋姑屬（Clintonia Raf.）植物.多年生草本，根狀莖；花白色，少有淡藍(lán)色；果實(shí)球形至矩圓形.常生長(zhǎng)在海拔1 600～4 000 m的高山陰坡樹林下［6-8］.有二倍體和四倍體兩種細(xì)胞型，二倍體分布從云南一直延伸到俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)，四倍體在東亞除分布于喜馬拉雅地區(qū)和日本以外，在陜西化龍山和湖北神農(nóng)架一帶有較為狹小的分布.兩種細(xì)胞型的個(gè)體只在種子大小上存在差異：二倍體種子較小，約3 mm×1.5 mm；四倍體種子較大，約4.5mm×2.2 mm［7］.野外調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，七筋姑具有出芽生殖情況，具有克隆生長(zhǎng).本文將采用SSR分子標(biāo)記對(duì)七筋姑不同倍型種群進(jìn)行克隆多樣性、克隆結(jié)構(gòu)研究，旨在了解七筋姑不同倍型克隆大小、空間格局，為揭示七筋姑不同倍型的克隆結(jié)構(gòu)、生態(tài)適應(yīng)提供基礎(chǔ)資料.

2　材料與方法

2.1材料采集

于2013年7月分別采自于陜西、湖北境內(nèi)四個(gè)地方：陜西化龍山北坡（32‘06 N，109'41 E）、陜西化龍山南坡（32‘01 N，109'35 E）、湖北金猴嶺（31‘47 N，110'30 E）、湖北木林子（30‘03 N，110'20 E），其中化龍山北坡和木林子兩個(gè)種群細(xì)胞型為四倍體；化龍山南坡和金猴嶺兩個(gè)種群細(xì)胞型為二倍體.

采樣策略：合理選取生長(zhǎng)比較好的區(qū)域作取材樣方，共取樣方4個(gè).采集新鮮、完整的七筋姑幼嫩葉片，用變色硅膠迅速干燥，待硅膠變色后馬上更換，直到葉片變脆，帶回實(shí)驗(yàn)室整理后，置于冰箱低溫保存?zhèn)溆?

表1　七筋姑SSR擴(kuò)增引物

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1基因組DNA的提取

采用改良的2×CTAB法［9-10］，所用器皿和試劑除有機(jī)溶劑外都經(jīng)過高壓滅菌之后用于提取七筋姑基因組DNA.用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA質(zhì)量.

2.2.2SSR-PCR引物篩選

從化龍山北坡、化龍山南坡、金猴嶺和木林子4個(gè)地方中選取質(zhì)量較好的DNA樣品，對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，從中初步篩選出多態(tài)性較高、合適的11對(duì)引物（表1）進(jìn)行分析.供篩選的引物由西安科昊生物工程有限責(zé)任公司研究開發(fā).

2.2.3PCR產(chǎn)物檢測(cè)

取8 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離.緩沖液為1×TBE，100 V電壓下預(yù)電泳30 min，點(diǎn)樣后，在200 V電壓下電泳3～4 h.

用銀染強(qiáng)堿法染色：將膠取下用雙蒸水洗膠2次，每次2 min；用含0.2%的AgNO3的染色液染色12 min；再用雙蒸水清洗30s；用含1.5%的NaOH和0.4%的甲醛顯影液顯影15 min，在此過程中充分搖動(dòng)，直到清晰地看到所有條帶；最后用雙蒸水清洗2次；將其取出觀察條帶、拍照并記錄［11］.

2.3數(shù)據(jù)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后獲得圖譜，在相近遷移位置上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，形成原始的“0，1”矩陣.多個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果顯示完全一致的樣本，可推測(cè)為同一個(gè)克隆系.分析種群的克隆結(jié)構(gòu)和克隆多樣性常見的幾種度量標(biāo)準(zhǔn)如下［12］：

（1）基株數(shù)目G：是種群中基株的總數(shù)，所有擴(kuò)增位點(diǎn)基因型相同的植株可視為同一個(gè)基株.

（2）平均克隆大小NC：表示平均每個(gè)基株含有的克隆分株數(shù)即N/G，N為樣本總數(shù).

（3）不同基因型比率（PD）：基株數(shù)目/樣本總數(shù)，即G/N.

（4）Simpson多樣性指數(shù)（D）：表示物種的多樣性和均勻度，也可衡量種群內(nèi)的克隆多樣性.D=1-∑｛ni（ni-1）/（N（N-1）｝，其中ni表示第i個(gè)基因型的分株數(shù)目.D值變動(dòng)范圍0到1，0表示種群所有樣本是同一種基因型，1表示所有的樣本都是不同的基因型.

（5）基因型分布均勻度Fager指數(shù)：E=（D-Dmin）/（Dmax-Dmin）；Dmin=｛（G-1）（2N-G）/N（N-1）｝；Dmax=｛N（G-1）/ G（N-1）｝.Fager指數(shù)表示種群內(nèi)基因型的均勻度，E=0表示種群內(nèi)所有個(gè)體的基因型都不同或有一個(gè)基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)而其他基因型都只有一個(gè)個(gè)體；E=1表示種群內(nèi)所有基因型有相同的個(gè)數(shù).

（6）局限性基因型：只有一個(gè)種群中出現(xiàn)的基因型［13］.（7）廣布型基因型：75%以上種群中出現(xiàn)的基因型［13］.

運(yùn)用POPGENE V1.31軟件對(duì)種群進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的運(yùn)算，觀察等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、Nei's基因多樣性指數(shù)（h）、Shannon多樣性指數(shù)（I）和多態(tài)位百分率（PPB）、種群總的基因多樣性（HT）、種群內(nèi)的基因多樣性（HS）、遺傳分化指數(shù)（GST）和基因流（Nm）［14］.

將所有樣本用字母標(biāo)注：化龍山北坡41個(gè)個(gè)體用字母A～AO表示，化龍山南坡31個(gè)個(gè)體用字母DR～EV表示，金猴嶺39個(gè)個(gè)體用字母CE～DQ表示，木林子41個(gè)個(gè)體用字母AP～CD表示（表2），將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MrBayes軟件分析每個(gè)個(gè)體及種群間的遺傳距離，將輸出結(jié)果用Figtree讀取遺傳距離圖［15］.

表2　七筋姑樣本個(gè)體字母標(biāo)記對(duì)照

采用SPSS16.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對(duì)七筋姑種群克隆結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析.

3　結(jié)果與分析

3.1七筋姑不同倍型的遺傳多樣性

從30對(duì)引物組合中選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性高的11對(duì)引物對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增.結(jié)果顯示（表3），二倍體種群的遺傳多樣性較低，其多態(tài)位百分率（PPB）為23.69%，觀察等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、基因多樣性指數(shù)（h）、Shannon多樣性指數(shù)（I）分別為1.236 9，1.202 7，0.108 3，0.153 7.四倍體種群遺傳多樣性表現(xiàn)出與二倍體相同的趨勢(shì)，PPB=19.73%，na=1.197 4，ne=1.1405，h=0.077 6，I=0.1126.

表3　七筋姑兩種倍型遺傳多樣性指數(shù)

種群總的基因多樣性（HT）為0.193 2，種群內(nèi)的基因多樣性（HS）為0.092 9.遺傳分化系數(shù)（GST）為0.518 8，表明遺傳變異主要存在于種群間.根據(jù)遺傳分化系數(shù)估算的基因流（Nm）為0.467 3，小于1，說明不同種群之間基因交流受到限制.

物種水平上，PPB為92.11%，表現(xiàn)出高的遺傳多樣性，其他多樣性指數(shù)分別為na=1.921 1，ne=1.258 1，h= 0.1933，I=0.329 1.物種水平的遺傳多樣性高于種群水平的遺傳多樣性.

對(duì)兩種倍型的不同種群遺傳多樣性指數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，二倍體種群遺傳多樣性高于四倍體.其順序?yàn)椋夯埳奖逼滤谋扼w（HLB）＜化龍山南坡二倍體（HLN）＜木林子四倍體（MLZ）＜金猴嶺二倍體（JHL）.

3.2七筋姑不同倍型%克隆多樣性

二倍體、四倍體種群中克隆基株的數(shù)目大小不一，所有種群都是多克隆群體，沒有發(fā)現(xiàn)單克隆構(gòu)型的種群（表4），而且在研究的4個(gè)種群152個(gè)樣本中出現(xiàn)了117個(gè)基因型，其中二倍體包含29.5個(gè)基因型，四倍體包含29個(gè)基因型，平均每個(gè)種群有29.25個(gè)克隆.

表4　七筋姑兩種倍型種群的克隆多樣性指數(shù)

根據(jù)Ellstrand&Roose［13］對(duì)局限基因型和廣布基因型的標(biāo)準(zhǔn)判斷，七筋姑為局限基因型，地域性分布比較明顯.二倍體種群平均克隆大?。∟C）平均為1.184，四倍體種群平均為1.441，物種水平上為1.299；二倍體種群不同基因型比率（PD）平均為0.846，四倍體種群平均為0.708，物種水平上為0.700；二倍體種群Simpson多樣性指數(shù)（D）為0.978，四倍體種群平均為0.961，物種水平上為0.992；二倍體種群基因型分布均勻度（E）平均為0.253，四倍體種群平均為0.621，物種水平上為0.887.克隆多樣性參數(shù)表明二倍體種群的克隆多樣性水平高于四倍體種群.

為了進(jìn)一步了解七筋姑對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)種群的克隆多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析（表5）.結(jié)果表明僅海拔與多樣性參數(shù)呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性，但并不顯著，其中不同基因型比率（PD）、Simpson多樣性指數(shù)（D）與海拔呈正相關(guān)，平均克隆大?。∟C）、基因型分布均勻度（E）與海拔呈負(fù)相關(guān)，說明海拔越高平均克隆大小越小，基因型分布越不均勻，而基因型比率越高，Simpson多樣性也越高.

表5　克隆多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性

3.3七筋姑不同倍型的克隆構(gòu)型

基于貝葉斯法在MrBayes軟件中進(jìn)行聚類分析（圖1），結(jié)果顯示化龍山北坡的四倍體種群所有個(gè)體聚為一支，木林子的四倍體種群所有個(gè)體聚為一支，化龍山南坡的二倍體種群所有個(gè)體聚為一支，金猴嶺的二倍體種群所有個(gè)體聚為一支.

圖1　七筋姑樣本遺傳距離聚類圖

兩種倍型4個(gè)種群之間遺傳距離存在差異，同一種群內(nèi)不同個(gè)體間遺傳距離也存在不同程度的差異（圖2）.二倍體種群為多克隆種群，化龍山南坡二倍體種群克隆系僅有1個(gè)，金猴嶺二倍體克隆系有2個(gè).四倍體種群同樣都為多克隆種群，化龍山北坡四倍體出現(xiàn)4個(gè)克隆系，木林子四倍體出現(xiàn)2個(gè)克隆系.并且不同種群之間沒有發(fā)現(xiàn)相同的基因型個(gè)體.

圖2　七筋姑不同倍型基因型分布示意圖

4　討論

4.1七筋姑不同倍型的克隆多樣性水平

克隆植物通過無性繁殖產(chǎn)生的后代，其基因型與親本完全相同，一直以來人們都認(rèn)為在克隆植物種群中遺傳多樣性很低，近些年隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記技術(shù)特別是SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)克隆植物種群中的克隆多樣性并沒有像預(yù)估的那么低［16］.本文研究發(fā)現(xiàn)兩種倍型的七筋姑種群都具有較高的遺傳多樣性，同時(shí)陜西和湖北境內(nèi)的二倍體種群遺傳多樣性高于四倍體.究其原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）該物種本身是多基因型起源的，即祖先基因多樣性就高，發(fā)展到現(xiàn)在仍然保持較高的基因多樣性；（2）七筋姑兼性有性生殖，不同個(gè)體交配繁育后代的遺傳變異為遺傳多樣性提供了可能；（3）很低的實(shí)生幼苗更新和補(bǔ)充都可以維持和增加種群內(nèi)的多樣性水平，文中七筋姑的平均克隆大小為1.299，說明存在幼苗的更新［17］.另外，二倍體遺傳多樣性高于四倍體可能是由于四倍體物種起源時(shí)間較短，其種群中還沒有積累比較多的遺傳變異［18］.

4.2七筋姑不同倍型的克隆構(gòu)型

Simpson多樣性指數(shù)D是反映植物克隆多樣性水平的主要特征值.本研究中七筋姑二倍體種群Simpson多樣性指數(shù)D平均值為0.978，四倍體平均值為0.961，顯示出兩種倍型七筋姑都具有較高的克隆多樣性，但二倍體種群略高于四倍體，可能因?yàn)閮煞N倍型的七筋姑生境都處于高海拔地區(qū)，相對(duì)貧瘠的環(huán)境使得該植物為了適應(yīng)環(huán)境進(jìn)行有性繁殖更新、補(bǔ)充實(shí)生苗，促使不同基因型的植株占據(jù)不同生境，增加對(duì)異質(zhì)空間資源的獲取能力；同時(shí)二倍體種群Simpson多樣性指數(shù)高于四倍體種群，說明二倍體種群克隆繁殖能力較強(qiáng)，由于二倍體生長(zhǎng)海拔普遍高于四倍體克隆，而克隆繁殖對(duì)于高寒環(huán)境是一種優(yōu)勢(shì)，二倍體相對(duì)較高的克隆繁殖增加了對(duì)環(huán)境的適合度.

本研究中兩種倍型七筋姑種群均為多克隆種群，沒有發(fā)現(xiàn)單克隆種群.根據(jù)克隆個(gè)體在空間上的分布而言，金猴嶺二倍體、化龍山北坡四倍體、木林子四倍體都出現(xiàn)多個(gè)克隆系，而化龍山南坡二倍體種群克隆系僅有1個(gè)，出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)基因型，形成了所有的克隆分株.種群中克隆系的數(shù)目可能是由于環(huán)境異質(zhì)性決定的，即不同基因型個(gè)體對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的不同造成了特定的基因型只能集中分布于特定的環(huán)境中［19］.化龍山南坡二倍體中僅存在1種基因型與環(huán)境高度適應(yīng)，成為優(yōu)勢(shì)基因型.兩種倍型種群內(nèi)同一克隆系的分株分布比較密集，不同基因型基株離散分布，說明兩種倍型七筋姑種群的克隆構(gòu)型均為混合型［20-21］，同時(shí)七筋姑不同倍型間均沒有明顯的鑲嵌現(xiàn)象，說明相同或相近的基因型幾乎出自同一個(gè)種群，為局限性基因型［17，22］.種群間的基因多樣性遠(yuǎn)高于種群內(nèi)，一方面證明了七筋姑地理分布范圍廣，種群間克隆分化程度高，另一方面也說明不同克隆種對(duì)生態(tài)適應(yīng)性不同.相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，僅海拔與各項(xiàng)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)較高的相關(guān)性，但并不顯著，經(jīng)緯度、溫差與降水量等并沒有對(duì)七筋姑的克隆多樣性產(chǎn)生較大的影響，可能由于上述環(huán)境因子并不是影響七筋姑有性繁殖與無性繁殖的相對(duì)比例的主要因素［23］.

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Clonalstructure of Different Cytotypes of Clintonia udensis

LIU Xin，LIU Li，ZHAO Liang，WANG Yiling
（College of Lifesciences，Shanxi Normal University，Linfen 041000，China）

Clintonia udensis is a member of Clintonia（Liliaceae）.As a perennial herbaceous plant，thisspecies has two cytotypes which include diploid and tetraploid.Thespecies can reproduce through root buds.In thisstudy，the clonal diversity and clonalstructure of C.udensis was analyzed based onsSR molecular markers.The resultsshowed that the diploid and tetraploid populations were all polyclonal populations，and that none monoclonal populations were found.There is a high clonal differentiation in two cytotypes.All the clonalstructure of C. udensis was“Guerilla”.152 C.udensissamples of four populations had 117 genotypes.The diploid had 29.9 genotypes，while the tetraploid had 29 genotypes.The average clone was 29.25 at the population level.Moreover，Simpson index（D）was 0.992 and genotype ratio（PD）was 0.700 atspecies level，which indicated high clonal diversity within C.udensis.The colnal diversity of diploid wasslightly higher than that of tetraploid.There is nosignificant correlation between clonal diversity and environmental factors based on correlation analysis.In conclusion，multiple origins of genotypes，facultativesexual reproduction and updatedseedlingsshould be thesources for maintaining rich genotypes within the C.udensis populations.

Clintonia udensis；clonalstructure；cytotypes

TU857

A

1008-2794（2015）04-0105-07

2016-04-12

王祎玲，教授，博士，研究方向：分子生態(tài)學(xué)，E-mail：ylwangbj@hotmail.com.