沙塘鱧線粒體基因組全序列的測定和分析

張燕萍，鄭紅梅，邵芳，韓曉磊，徐建榮，顧志良

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003）

沙塘鱧線粒體基因組全序列的測定和分析

張燕萍1，鄭紅梅1，邵芳2，韓曉磊1，徐建榮1，顧志良1

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇常州213003）

為揭示沙塘鱧（Odontobutis）線粒體基因組特征，采用PCR擴增和測序的方法獲得沙塘鱧（Odontobutis）線粒體基因組全序列.通過生物信息學(xué)軟件（tRNAscan-SE、RNAfold）定位沙塘鱧線粒體基因組基因結(jié)構(gòu)及預(yù)測tRNA和rRNA的二級結(jié)構(gòu).沙塘鱧線粒體基因組全長16 930 bp，結(jié)構(gòu)組成和其他硬骨魚基本一致，包括13個蛋白質(zhì)編碼基因，22個tRNA，2個rRNA和1個D-loop區(qū). 13個蛋白質(zhì)編碼基因中，除了CO1是以GTG作為起始密碼子，ND6以TTA作為起始密碼子以外，其余都以ATG起始.沙塘鱧線粒體基因的終止密碼子有3種類型，分別為完全密碼子TAA、不完全密碼子TA和T.除了tRNASer（AGN）和tRNACys外，其余20個tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)都是典型的三葉草結(jié)構(gòu).識別了沙塘鱧終止序列區(qū)、中央保守區(qū)D、E、F和保守序列區(qū)CSB-1、CSB-2和CSB-3.比較沙塘鱧cytb基因序列與其他物種同源性發(fā)現(xiàn)，沙塘鱧與平頭沙塘鱧的同源性最高（87.03%），河川沙塘鱧次之（83.57%），與人的同源性最低（70.64%）.該研究結(jié)果可為深入探討沙塘鱧屬及塘鱧科魚類的系統(tǒng)分類提供依據(jù)，更真實地反映了沙塘鱧的分類地位和進化關(guān)系.

沙塘鱧；線粒體DNA序列；D-Loop區(qū)；系統(tǒng)進化

魚類是脊椎動物中最原始而在種屬數(shù)量上又最占優(yōu)勢的類群，其起源復(fù)雜，分布廣泛，擁有豐富的遺傳多樣性［1］.在分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于魚類分類之前，人們主要從魚類化石資源、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征等方面探求魚類的遺傳進化歷程，但由于多種客觀條件限制，使得傳統(tǒng)的分類學(xué)方法難以徹底解決魚類遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化等問題.近年來，隨著魚類線粒體DNA（mitohondrial DNA，mtDNA）研究技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，使其成為魚類學(xué)相關(guān)研究的重要標(biāo)記，并在魚類進化遺傳學(xué)、種群遺傳結(jié)構(gòu)、分子生態(tài)學(xué)和保護生物學(xué)等方面取得了很多有意義的成果［2］.mtDNA同其他脊椎動物一樣，是細(xì)胞核外具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA.與核DNA相比，魚類mtDNA具有分子較小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、遺傳相對獨立性和母系遺傳等特點，是一個相對獨立的復(fù)制單位［3-4］.

目前已經(jīng)報道了上百種魚類線粒體DNA的全序列，發(fā)現(xiàn)魚類mtDNA分子大小在15～19 kbp之間，主要包括37個編碼基因13個蛋白基因、2個rRNA基因、22個tRNA編碼基因）、1個負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始的控制區(qū)（D-loop）和1個輕鏈復(fù)制起始區(qū)［5］.蛋白質(zhì)和tRNA基因的進化速度適中，適合于從種間到種內(nèi)遺傳差異分析，作為線粒體上唯一的結(jié)構(gòu)和功能被了解得較為清楚的蛋白質(zhì)編碼基因，Cytb基因容易用一些通用引物擴增和測序，因而Cytb基因被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進化研究［6］.

沙塘鱧屬鱸形目（Perciformes）、蝦虎魚亞目（Gobioidei）塘鱧科（Eleotridae）、沙塘鱧屬（Eleotris），是分布于我國長江中下游以及錢塘江、閩江水系的中小型溪流經(jīng)濟魚類.沙塘鱧肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟價值高，由于自然環(huán)境的改變，其數(shù)量急劇衰減.目前對沙塘鱧的養(yǎng)殖技術(shù)研究廣泛，但其基因水平的研究甚少，基因庫中線粒體基因序列公布很少.本實驗采用PCR擴增和測序的方法，獲得沙塘鱧線粒體DNA的全序列，確定了沙塘鱧線粒體基因組編碼的所有基因，還分析了沙塘鱧線粒體基因組的堿基組成、基因排列和密碼子使用情況.本研究擴充了魚類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，為其系統(tǒng)分類提供分子水平證據(jù)，同時為沙塘鱧群體遺傳學(xué)和生物資源的合理利用等提供有價值的資料.

1　材料與方法

1.1實驗材料和總DNA的提取

沙塘鱧由蘇州市長江特色水產(chǎn)繁殖工程中心提供，活魚宰殺后，采集肌肉組織放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?采用經(jīng)典的酚-氯仿法提取沙塘鱧肌肉總DNA，用NanoDrop2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及完整性，于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2引物設(shè)計與PCR擴增、測序

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布塘鱧科線粒體部分序列以及其他相關(guān)物種的同源性保守序列設(shè)計引物.引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）.PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，然后加去離子水17.3 μL至終體積25 μL.PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，運行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存.另外，依據(jù)引物的長短對退火溫度、延伸時間和循環(huán)次數(shù)做了相應(yīng)的調(diào)整.將所有PCR產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒進行純化.將PCR得到的回收產(chǎn)物進行直接測序，測序均由上海生工生物工程有限公司完成.

表1　PCR擴增引物序列

1.3序列拼接、注釋和分析

使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行序列比對、拼接，再經(jīng)測序峰圖結(jié)果分析軟件Chromas仔細(xì)校正后，得到沙塘鱧線粒體全序列.使用Gene Runner軟件統(tǒng)計全序列的各堿基百分比，蛋白質(zhì)編碼基因的堿基使用情況.使用軟件tRNAscan-SE（http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）定位tRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因和D-loop區(qū)，以確定沙塘鱧線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu).用RNAfold軟件（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/ RNAfold.cgi）預(yù)測rRNA基因的空間二級結(jié)構(gòu)和自由能值.

1.4進化分析

將獲得的沙塘鱧線粒體Cytb基因DNA序列與GenBank已經(jīng)公布的中華烏塘鱧等17個物種線粒體全基因組的Cytb基因序列進行比對，利用MEGA軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建分子進化樹.

2　結(jié)果與分析

2.1線粒體基因組結(jié)構(gòu)

沙塘鱧線粒體基因組全長為16930 bp，共編碼37個基因包括13個蛋白質(zhì)編碼基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因及一個介于tRNAPro和 tRNAPhe之間的D-loop區(qū)，沙塘鱧線粒體基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示.這37個編碼基因在沙塘鱧線粒體基因組中的分布呈不均一性，L鏈上編碼9個基因，包括8個tRNA基因（tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer（UCN）、tRNAGlu、tRNAPro）和一個編碼蛋白的基因ND6；其余的28個基因則由H鏈編碼.

圖1　沙塘鱧線粒體基因組結(jié)構(gòu)組成

沙塘鱧線粒體基因組有15處基因間隔區(qū)域，長度范圍在1～336 bp之間，共518 bp，最大的基因間隔出現(xiàn)在tRNALeu（CUN）和tRNAHis這兩個基因之間.基因組中還存在5處重疊，長度范圍在1～7 bp之間，共計20 bp，最大基因重疊出現(xiàn)在ATPase8和ATPase6及ND4L和ND4之間.既沒重疊，也沒有間隔的緊密排列基因?qū)灿?8處.沙塘鱧線粒體基因各個基因大小及分布見表2.

加下劃線“_”的基因在L鏈上編碼；tRNA基因用氨基酸單字母表示；L1、L2和S1、S2分別表示tRNALeu（CUN）、tRNALeu（UUR）和tRNASer（AGN）、tRNASer（UCN）

表2　沙塘鱧線粒體基因組的基因組成

2.2線粒體堿基組成

沙塘鱧線粒體基因組堿基百分含量見表3.蛋白編碼基因4種堿基百分含量與整個線粒體基因組最為相似.在不同密碼子堿基含量的問題上，密碼子第一位點的4種堿基含量較為接近，沒有堿基使用偏好；第二位點T的含量最高，為36.5%，G含量最低，為12.5%，顯示出T偏倚和反G偏倚；第三位點反G偏倚最明顯，平均含量僅為9.2%.

2.3蛋白編碼基因及密碼子使用

沙塘鱧的13個蛋白編碼基因總長度為11 419 bp，占線粒體全長的67.4%.13個蛋白編碼在堿基組成上都有明顯的反G偏倚.所用的起始密碼子除CO1基因為GTG，ND6基因為TTA外，其余均為ATG.常用的終止密碼子有3種類型，包括完全密碼子TAA和不完全密碼子TA以及T，如：CO1、ATPase8、ND4L、ND5是以TAA為終止密碼子；ND2、ATPase6、CO3是以TA為終止密碼子，其余都是以T終止的.

2.4tRNA二級結(jié)構(gòu)

沙塘鱧線粒體基因組有22個tRNA基因，全長1 565 bp，單個基因長度為67～81 bp，其中14個由L鏈編碼，8個由H鏈編碼.通過tRNAscan-SE軟件預(yù)測并確定了沙塘鱧線粒體22個tRNA基因的位置及二級結(jié)構(gòu).除tRNASer（AGN）和tRNACys基因的結(jié)構(gòu)比較特殊外，其余均能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu).其中氨基酸臂最保守，長度都為7 bp，TψC臂和反密碼子臂為4～5 bp，DHU臂為2～4 bp.TψC環(huán)為7 bp（除Lys為9 bp，Phe為8 bp），反密碼子環(huán)為7 bp（除Thr、Val為9 bp），而DHU環(huán)的堿基數(shù)差別很大，在4～11 bp之間.沙塘鱧的20個tRNA基因中共有16對不匹配的堿基配對.其中位于氨基酸臂上的有10對，分別為tRNAAsn、tRNAAsp、tRNAHis、tRNAIle、tRNALeu（CUN）、tRNAPhe、tRNASer（UCN）、tRNAThr、tRNATrp、tRNAVal；4對在TψC臂上，分別為tRNAHis、tRNAMet（有2對）、tRNATrp；2對在反密碼子臂上，分別為tRNAAla、tRNAVal.其中6個AC錯配，3個UC錯配，3個UU錯配，2個AA錯配，2個 CC錯配.

2.5rRNA二級結(jié)構(gòu)

沙塘鱧rRNA基因由12S rRNA和16S rRNA兩種組成，分別位于tRNAPhe和tRNAVal、tRNAVal和tRNALeu（UUR）之間，其長度分別為951 bp和1 654 bp.rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)很保守，形成多個大小不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其進化速度在線粒體各基因組分中最慢.通過RNAfold在線軟件預(yù)測出了沙塘鱧兩種rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)，其中，12S rRNA基因的自由能值為-234.90 kcal/ mol，16S rRNA基因的自由能值為-422.30 kcal/mol.一般而言，自由能值越低則代表其分子結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，表明沙塘鱧12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守.

2.6D-loop控制區(qū)

沙塘鱧D-loop控制區(qū)長度為844 bp.A+ T含量（64.34%）顯著高于基因組全序列的A+ T含量（55.5%）.這與其他魚類A、T含量高，G、C含量低的特點很一致.沙塘鱧線粒體D-loop區(qū)分為終止序列區(qū)（termination associatedsequence，TAS）、中央保守區(qū)（central conserved dormain，CD）和保守序列區(qū)（conservedsequence block，CSB）3個區(qū)段.以CSB-F和CSB-1的起點分別作為終止序列區(qū)，中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的分界線見圖2.

接表1

表3　沙塘鱧線粒體不同基因的堿基組成

終止區(qū)是控制區(qū)變異最大的區(qū)域，沙塘鱧的終止結(jié)合序列區(qū)長度為280 bp，在此區(qū)段中識別了2個終止相關(guān)序列（TAS），其中包括核心序列TACAT及其反向互補序列ATGTA，其二級結(jié)構(gòu)可形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象在許多類群中存在.經(jīng)比對得到沙塘鱧的ETAS序列為：TACAT-TATGTATTA-CCATATAT-ATATAACCATA（“-”表示發(fā)生變異的堿基，即轉(zhuǎn)換、顛換或缺失）.

沙塘鱧中央保守區(qū)為355 bp，分為CSB-F、E、D.其中CSB-F是分開終止序列區(qū)和中央保守區(qū)的標(biāo)志，關(guān)鍵形式為：ATGCAGATAAG-A-ACATTC，但存在變異.緊跟其后是CSB-E，關(guān)鍵序列為：AGGGACAA-TTGTGGGGGTTTCAC，含有GTGGG-box .CSB-D，序列為：GTGAACTATTCCTGGCATTTGGTTCCTATTTCAGGGCCATT-，CSB-D和CSB-E保守性都要高于CSB-F.

沙塘鱧的保守序列區(qū)總長為209 bp，包括CSB-1、CSB-2和CSB-3.研究表明CSB-1與mtDNA的復(fù)制起始相關(guān)，3段CSB序列都被確定，其中CSB-1的關(guān)鍵序列為：-TTGCATAACTGATATCAAGAGCATA-；CSB-2的關(guān)鍵序列為：AAACCCCCCTACCCCCCACTC；CSB-3的關(guān)鍵序列為：TCCTGAAACCCCCCGGAAACAGGAA.

圖2　沙塘鱧線粒體基因組控制區(qū)序列與特征

中央保守序列（CSB-F，CSB-E，CSB-D）、保守序列（CSB-1，CSB-2，CSB-3）用下劃線表示；終止相關(guān)序列（TAS）用陰影表示，它的反向互補序列（ATGTA）用雙下劃線表示.

2.7基于Cytb基因的系統(tǒng)進化分析

2.7.1沙塘鱧與其他物種的同源性

利用DNAMAN軟件，將沙塘鱧Cytb基因序列分別與其他參照物種的Cytb基因進行比對，得到沙塘鱧與其他物種的同源性系數(shù)（見表4）.可見沙塘鱧與平頭沙塘鱧的同源性最高（87.03%），河川沙塘鱧次之（83.57%），與人的同源性最低（70.64%）.

表4　沙塘鱧與對照物種的同源性系數(shù)

2.7.2基于Cytb基因序列的系統(tǒng)進化樹

利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建表4中17個物種的分子進化樹（圖3）.結(jié)果表明，所有硬骨魚形成一個大的分支，哺乳類形成另一個分支.硬骨魚又分為4個獨立的小分支，沙塘鱧首先與平頭沙塘鱧聚成一支，接著與河川沙塘鱧、暗色沙塘鱧聚類，這4種魚類都屬于鱸形目沙塘鱧科沙塘鱧屬，接著這4種沙塘鱧屬魚類與葛氏鱸塘鱧（鱸塘鱧屬）聚類，再與小黃黝魚（小黃黝魚屬）聚類，這6種沙塘鱧科魚類形成獨立的分支；黑塘鱧、彩塘鱧、中華烏塘鱧、巧塘鱧和脂塘鱧則單獨形成另一個小的分支，這5種魚類同屬于鱸形目的塘鱧科；鱸形目鯖科魚類形成另一個分支；而屬鰈形目的石鰈和屬鲉形目的松江鱸則形成其他分支.結(jié)果從另一個方面證實沙塘鱧在魚類分類系統(tǒng)中的位置，此外還說明鱸形目不同科的魚類親緣關(guān)系有遠(yuǎn)近之分，沙塘鱧科魚類與鯖科魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn).這與動物形態(tài)學(xué)分類基本一致.

圖3　基于沙塘鱧cytb基因序列構(gòu)建的NJ法系統(tǒng)樹

3　討論與結(jié)論

3.1沙塘鱧線粒體基因組分析

本研究測定了沙塘鱧的線粒體基因組全序列，全長為16 930 bp，共編碼37個基因.沙塘鱧線粒體基因組的基因排列順序與已公布的其他魚類線粒體基因組的基因排列順序完全一致，各基因長度也大致相等［4，7-8］，其mtDNA的分子大小在種間存在差異主要是由于串聯(lián)重復(fù)序列的存在以及長度不等的堿基插入和缺失，如沙塘鱧在基因tRNATrp和tRNAAla之間間隔6 bp，巖原鯉（Procypris rabaudi）只有2 bp的重復(fù)［9］.沙塘鱧線粒體基因組A、T、C、G這4種堿基的含量都非常接近，且A+T含量高于C+G含量，這與已報道的絕大多數(shù)魚類線粒體基因組堿基含量分布一致；蛋白編碼基因4種堿基百分含量與整個線粒體基因組最為相似［8，10-11］.13個蛋白編碼基因分3種類型終止密碼子，除了CO1、ATPase8、ND4L、ND5是以完全密碼子TAA為終止密碼子外，其余都是以不完全終止密碼子TA或T終止翻譯.這種以不完整的密碼子終止翻譯的現(xiàn)象在后生動物的線粒體基因組中較為常見，這些不完整的終止密碼子可以通過轉(zhuǎn)錄為mRNA后由3′端的多聚腺苷酸化作用將其補全變成完整的終止密碼子（TAA）［12］.

沙塘鱧的22種tRNA除了tRNACys以及tRNASer（AGN）DHU臂發(fā)生缺失外，其余20種tRNA均呈典型的三葉草結(jié)構(gòu).沙塘鱧12S rRNA基因比16S rRNA基因自由能值低，說明12S rRNA比16S rRNA更保守，這和大多數(shù)魚類的研究結(jié)果一致.魚類二級結(jié)構(gòu)總體差異較大，沒有明顯規(guī)律，因此不利于對物種間的rRNA二級結(jié)構(gòu)做詳細(xì)比較［13］.

線粒體DNA控制區(qū)又稱D-環(huán)區(qū)（D-loop），位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，是整個線粒體DNA序列中長度變異最大的區(qū)域，也是線粒體基因組上進化最快的部分.魚類線粒體D-loop區(qū)分為H-鏈復(fù)制起始區(qū)OH、TAS區(qū)、CD、CSB區(qū)、L-鏈啟動子和H-鏈啟動子.D-loop區(qū)是mtDNA中替換率最高和堿基數(shù)量最易發(fā)生變化的區(qū)域.目前識別了D-loop的中央保守區(qū)的保守序列B、C、D、E、F .Randi等發(fā)現(xiàn)保守序列C、D、E、F在鳥類中存在［14］.Lee等對眾多魚類序列進行比較時，僅識別了CSB-D的存在［15］，隨后相繼有人識別出了魚類的CSB-E和CSB-F［16］.本實驗識別出了沙塘鱧控制區(qū)的終止序列區(qū)，這是控制區(qū)最易發(fā)生變異的區(qū)域，還識別了中央保守區(qū)序列CSB-F、CSB-E、CSB-D和保守區(qū)序列CSB-1、CSB-2、CSB-3并給出關(guān)鍵序列.然而金逍逍等人發(fā)現(xiàn)包括刺蓋塘鱧、中華烏塘鱧在內(nèi)的26種蝦虎魚存在不同的缺失現(xiàn)象，未能識別到CSB-F［16］.多數(shù)魚類識別到CBS-E的核心序列（GTGGG），CSB-D序列則相對較為保守，這可能與其參與線粒體代謝及重鏈復(fù)制有關(guān)聯(lián)［15］.

3.2沙塘鱧進化分析

沙塘鱧科魚類隸屬鱸形目蝦虎魚亞目，而蝦虎魚類是鱸形目魚類中最大的一個類群.塘鱧科產(chǎn)于中國有5個屬，其中包括沙塘鱧屬（Odontobutis）和鱸塘鱧屬（Perccottus）等，這兩個屬常見的經(jīng)濟種類有河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）、鴨綠沙塘鱧（Odontobutis yaluensis）、中華沙塘鱧（Odontobutissinensis）、葛氏鱸塘鱧（Perccottus glenii）等［17］.伍漢霖等從形態(tài)學(xué)上將中國沙塘鱧屬魚類分為河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、海豐沙塘鱧（Odontobutis haifengensis）4個種［18］.但由于蝦虎魚類形態(tài)上的多樣性以及不同程度的退化與特化，導(dǎo)致單純依據(jù)形態(tài)學(xué)對其鑒定顯得較為困難，很多分類結(jié)果一直存在爭議［19-20］.

鑒于以上種種原因，線粒體基因作為分子標(biāo)記應(yīng)用到魚類的物種鑒別、分類及系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域，相比于形態(tài)學(xué)研究，分子生物學(xué)分析方法能很好地克服魚類形態(tài)特征多樣性、特性特征不明顯等困難，能更真實有效地反映其分類地位和進化關(guān)系.謝楠等［21］基于cytb基因序列分析了蝦虎魚亞目9個屬的進化關(guān)系，塘鱧屬與黃黝魚屬2個屬構(gòu)成1支；沙塘鱧屬與鱸塘鱧屬2個屬構(gòu)成1支；烏塘鱧屬、嵴塘鱧屬、尖塘鱧屬、頭孔塘鱧屬4個屬構(gòu)成1支；鰭塘鱧屬單獨構(gòu)成1支，未能在亞科水平上聚類.同樣我們基于沙塘鱧的cytb基因序列構(gòu)建了類似的系統(tǒng)進化樹，沙塘鱧屬4種魚類聚類，接著與葛氏鱸塘鱧（鱸塘鱧屬）聚類，再與小黃黝魚（小黃黝魚屬）聚類；塘鱧科同樣也發(fā)生聚類，這一結(jié)果能夠在科及屬水平上達(dá)到聚類.侯新遠(yuǎn)等［22］基于線粒體D-loop序列研究我國5種蝦虎魚類的進化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、中華沙塘鱧、平頭沙塘鱧聚為一大支，刺蓋塘鱧、黑體塘鱧、褐塘鱧、尖頭塘鱧、溪鱧、葛氏鱸塘鱧聚為另一支，這與我們得出葛氏鱸塘鱧與沙塘鱧科魚類聚類卻未與塘鱧科魚類聚類的結(jié)果不同，這說明選擇不同的基因在系統(tǒng)發(fā)育研究中存在差異.該研究結(jié)果可為深入探討沙塘鱧屬及塘鱧科魚類的系統(tǒng)分類提供依據(jù).

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Sequencing and Analysis of the Complete Mitochondrial Genome of Odontobutis

ZHANG Yanping1，ZHENG Hongmei1，SHAO Fang2，HAN Xiaolei1，XU Jianrong1，GU Zhiliang1
（1.School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500；2.Cancer Institute，Changzhousecond People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Changzhou 213003，China）

The entire mitochondrial genome of Odontobutis was obtained by PCR based on conservative primers. It wasshowed that the mitochondrial genomesequence was 16，930 bp long，including 13 protein genes，22 tRNA genes，2 rRNA genes and a noncoding region.The base composition of the genome was A 30.0%，C 28.9%，G 15.6%and T 25.5%.Protein-coding genes in Odontobutis mitochondrial genome used ATG as the initiation codons with the exception of CO1 which used GTG and ND6 used TAA.It was found thatstop codons in Odontobutis included TAA，uncomplement codons TA and T.Most tRNA genes could form typicalsecondarystructures except tRNASer（AGN）and tRNACys.In addition，the D-loop region of Odontobutis mtDNA was 844 bp in length.Compared with the mitochondrial DNA control region from otherspecies，the extended terminal associatedsequences，central conservedsequence blocks，conservedsequence blocks and putative promoters of the mitochondrial DNA control region in Odontobutis were observed.Sequence alignment of Cyt b genes of Odontobutis and other 10species from GenBankshowed that Odontobutis obscara and Odontobutis had the closest genetic relationship in the 11species.A phylogenetic tree constructed using the Neighbor-Joining method indicated that the relationship amongsleeper Branch was close，the next weresculpin Branch andsciaenidae，and Cyprinid was distantly related.

Odontobutis；mitochondrial DNAsequence；D-Loop region；phylogeny

Q493；Q75

A

1008-2794（2015）04-0097-05

2016-04-12

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（第42批）“鳡魚和赤眼鱒線粒體基因組及進化關(guān)系研究”；蘇州市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)項目“農(nóng)業(yè)動物（畜禽、水產(chǎn)）種質(zhì)研究重點實驗室”（SZZD201001）

顧志良，教授，博士，研究方向：動物分子遺傳學(xué)，E-mail:zhilianggu88@hotmail.com.