不同程度間歇低氧對3T3-L1脂肪細胞NF-κB、IL-10和內(nèi)脂素的影響

韓苗苗，周芹，馮靖，牛文彥，何慶△

不同程度間歇低氧對3T3-L1脂肪細胞NF-κB、IL-10和內(nèi)脂素的影響

韓苗苗1，周芹2，馮靖3，牛文彥4，何慶2△

目的測定不同程度間歇低氧（IH）處理的脂肪細胞中核因子（NF）-κB、白細胞介素（IL）-10及內(nèi)脂素水平的變化，探討IH導致胰島素抵抗的機制。方法建立阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）模式間歇低氧/再氧合（IH/ ROX）細胞模型，將分化成熟的脂肪細胞3T3-L1隨機分為10組，包括4個不同程度IH組（IH1、IH2、IH3、IH4，先充入1.5%O245 s，各組分別充入21%O22 min 15 s、4 min 15 s、5 min 45 s、8 min 45 s，每組60個循環(huán)）及各自的正常氧對照組（SC1、SC2、SC3、SC4，將各IH組中1.5%O2改為21%O2，其余同IH組處理）、持續(xù)低氧組（CH，10%O26 h）及持續(xù)正常氧對照組（CC，21%O26 h）。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定3T3-L1上清液中IL-10和內(nèi)脂素水平；采用Western Blotting法測定脂肪細胞內(nèi)脂素及細胞核NF-κB p65的蛋白水平；采用real-time PCR方法測定脂肪細胞IL-10、內(nèi)脂素的mRNA水平。結果IH組和CH組IL-10蛋白及mRNA的表達水平明顯低于各自對照組（P＜0.01）。IH和CH組NF-κB p65蛋白水平高于各自對照組。IH1、IH2組和CH組內(nèi)脂素蛋白及mRNA的表達水平高于各自對照組（P＜0.01）。結論IH作為OSA的主要病生理特征，其可能通過導致脂肪細胞NF-κB、IL-10和內(nèi)脂素的分泌異常，參與OSA患者胰島素抵抗的發(fā)生。

睡眠呼吸暫停，阻塞性；間歇低氧；胰島素抵抗；NF-κB；煙酰胺磷酸核糖基轉移酶；白細胞介素10；內(nèi)脂素

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種睡眠期間上氣道反復發(fā)生完全（呼吸暫停）或部分（低通氣）塌陷導致的以間歇低氧（IH）、高碳酸血癥、胸內(nèi)壓改變和夜間反復覺醒為特征的常見慢性疾病。OSA在30～60歲人群中患病率為2%～4%，在老年人群中患病率約15%［1］，嚴重影響患者的生活質量和壽命。研究表明，OSA是獨立于肥胖等因素外導致胰島素抵抗（IR）的重要危險因素［2］。作為OSA的主要病理特征，IH對機體造成的損傷更加嚴重，可引起系統(tǒng)性炎癥，在代謝功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。目前，IH促進代謝紊亂的確切機制尚不完全清楚，其可能機制為交感神經(jīng)持續(xù)興奮和下丘腦-垂體-腎上腺軸興奮性增高、活性氧（ROS）形成、核因子（NF）-κB等促炎通路的激活、抗炎細胞因子白細胞介素（IL）-10水平下降及內(nèi)脂素水平改變等［2］。本研究通過建立脂肪細胞不同程度IH模型，探討不同程度的IH對脂肪細胞中NF-κB、IL-10和內(nèi)脂素分泌的影響，為臨床治療提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料3T3-L1前脂肪細胞株（加拿大Amira Klip教授惠贈），細胞質提取液A、細胞質抽提液B、細胞核抽提液（美國，ActiveMotif），IL-10和內(nèi)脂素酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Invitrogen公司），β-actin引物序列（北京華大基因），內(nèi)脂素、IL-10引物序列（北京奧科生物技術有限責任公司）。

1.2主要儀器細胞孵育箱（Thermo Electron Corporation，Model 3111），空氣壓縮裝置（鞍山佳誠空壓機有限公司），血氣分析儀（瑞士AVILOMNI血氣自動分析儀），高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司），real-time PCR儀7500型（Applied Biosystems，美國）。

1.3方法

1.3.1IH暴露脂肪細胞及分組參考文獻［3］，對3T3-L1前脂肪細胞株進行培養(yǎng)、誘導分化、處理。將分化成熟的細胞隨機分為10組，包括4個不同程度IH組（IH1、IH2、IH3、IH4，先充入1.5%O245 s，各組分別充入21%O22 min 15 s、4 min 15 s、5 min 45 s、8 min 45 s，每組60個循環(huán)）及各自的正常氧對照組（SC1、SC2、SC3、SC4，將IH組中1.5%O2改為21% O2，其余同IH組處理）、持續(xù)低氧組（CH，10%O26 h）及持續(xù)正常氧對照組（CC，21%O26 h）。所有氧艙均放置在37℃細胞孵化器中，各實驗組均在以上實驗裝置中每天暴露6 h，共暴露48 h。測定脂肪細胞培養(yǎng)基中的氧分壓［p（O2）］、二氧化碳分壓［p（CO2）］。

1.3.2標本采集與處理每組提取脂肪細胞培養(yǎng)基各3 mL。PBS清洗，刮下貼壁細胞，轉移細胞懸液至離心管，4℃下600 r/min離心，收集細胞。細胞沉淀加入細胞質提取液A，漩渦振蕩重懸細胞沉淀，冰浴后加入細胞質抽提液B，漩渦振蕩后離心，棄去上清液；用細胞核抽提液重懸含細胞核的沉淀，反復重懸冰浴后離心，將上清液作為細胞核抽取物凍存待用。

1.3.3NF-κB p65、IL-10及內(nèi)脂素的測定采用ELISA方法，嚴格按說明書進行操作，酶標儀測定脂肪細胞上清液中IL-10和內(nèi)脂素平均吸光度（A）值，繪制標準曲線。采用Western blotting法測定脂肪細胞內(nèi)脂素及細胞核NF-κB p65的蛋白水平，分別以β-actin和SP3蛋白水平作為內(nèi)參。用real-time PCR檢測脂肪細胞中IL-10、內(nèi)脂素mRNA表達水平。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性5 min；95℃30 s，57℃1 min，72℃30 s，40個循環(huán)。以β-actin基因的表達量作為內(nèi)參，結果以2-ΔΔCt表示。重復檢測3次取平均值。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1脂肪細胞IH模型成功建立成熟脂肪細胞胞質內(nèi)含有串狀脂滴，說明3T3-L1細胞已分化為成熟的脂肪細胞，見圖1。IH組培養(yǎng)基p（O2）、p（CO2）及pH實測值范圍分別為48.3～77.6 mmHg（1 mmHg= 0.133 kPa）、35.9～40.9 mmHg、7.33～7.42，本模型可在細胞水平產(chǎn)生IH暴露環(huán)境。

Fig.13T3-L1 adipocytes（HE staining，×10）圖1　3T3-L1脂肪細胞（HE染色，×10）

2.2上清液中IL-10、內(nèi)脂素水平變化IH組和CH組細胞的上清內(nèi)IL-10水平明顯低于各自對照組（P＜0.01），IH2、IH3組與CH組比較上清內(nèi)IL-10含量降低（P＜0.01），IH3組較IH1、IH4組明顯降低（P＜0.01）。IH1、IH2和CH組上清內(nèi)脂素含量顯著高于各自對照組（P＜0.01），且IH3、IH4組上清內(nèi)脂素含量明顯低于IH1、IH2和CH組（P＜0.01），見表1。

2.3脂肪細胞內(nèi)脂素蛋白水平、NF-κB p65核轉移變化IH1、IH2和CH組與SC1、SC2、CC組相比，內(nèi)脂素蛋白表達量增多，而IH3、IH4組與SC3、SC4組相比，內(nèi)脂素蛋白表達量降低，見圖2。細胞核NF-κB p65蛋白水平在IH1～4組和CH組與SC1～4及CC組相比，蛋白表達量均升高；且IH組較CH組蛋白量增多明顯，見圖3。

2.4脂肪細胞IL-10和內(nèi)脂素mRNA的水平結果顯示，IL-10 mRNA表達IH組和CH組明顯低于各自對照組。內(nèi)脂素mRNA的表達IH1、IH2和CH組顯著高于其各自對照組，見表1。

Tab.1The levels of supernate IL-10，visfatin protein and mRNA in different groups表1　各組脂肪細胞上清液中IL-10和內(nèi)脂素蛋白及各組細胞中mRNA水平比較（n=3，）

Tab.1The levels of supernate IL-10，visfatin protein and mRNA in different groups表1　各組脂肪細胞上清液中IL-10和內(nèi)脂素蛋白及各組細胞中mRNA水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a～d分別為與SC1～4組比較，e與CC組比較，f～i分別為與IH1～4組比較，P＜0.01

內(nèi)脂素mRNA 1±0 1±0 1±0 1±0 1±0 1.96±0.07a 1.64±0.49b 0.94±0.04 0.88±0.01 1.54±0.05e 171.880＊＊組別SC1組SC2組SC3組SC4組CC組IH1組IH2組IH3組IH4組CH組F上清液IL-10（ng/L）12.85±0.09 12.68±0.04 13.23±0.07 13.13±0.08 13.69±0.17 7.15±0.12a 6.44±0.10b 5.40±0.07cf 7.43±0.11dh 8.16±0.05egh 244.412＊＊上清液內(nèi)脂素（ng/L）8.98±0.16 9.14±0.11 6.61±0.03 7.54±0.12 10.20±0.04 16.47±0.06a 16.30±0.06b 6.58±0.05fg 7.46±0.04fg 16.32±0.07ehi 7 227.000＊＊IL-10 mRNA 1±0 1±0 1±0 1±0 1±0 0.57±0.02a 0.55±0.01b 0.34±0.01c 0.62±0.01d 0.73±0.01e 1 217.000＊＊

3　討論

3.1IH對脂肪細胞NF-κB分泌的影響在低氧狀態(tài)下，脂肪細胞相應地表達大量的低氧反應基因并激活炎癥因子轉錄來適應低氧狀態(tài)，包括低氧誘導因子（HIF）-1和NF-κB等［4］。NF-κB通常與其抑制蛋白IκB相結合，IκB阻止NF-κB進入細胞核。炎性因子或細胞刺激因子暴露時，細胞信號轉導通路激活，IκB降解，NF-κB由胞漿轉位至胞核，調節(jié)炎癥基因的轉錄激活，引發(fā)炎癥反應［5］。研究證實，炎癥反應是促進IR的一個重要因素。本實驗結果顯示，NF-κB p65蛋白水平在各IH組和CH組較各自對照組增加。與以往研究結果相符［6］。OSA模式下IH使NF-κB從IκB上解離，激活炎癥因子轉位至細胞核并轉錄，使機體處于炎癥狀態(tài)，導致胰島素水平異常，誘導IR。Oliver等［7］研究表明IH主要通過經(jīng)典信號通路的方式，增強NF-κB基礎活性及LTα 1β2誘導的NF-κB活性。本研究還發(fā)現(xiàn)IH組脂肪細胞核NF-κB p65蛋白水平較CH組增加，說明IH后再氧合，產(chǎn)生ROS，亦可激活NF-κB，從而增加系統(tǒng)性炎癥反應。

3.2IH對脂肪細胞IL-10分泌的影響IL-10具有炎癥抑制作用，能抑制巨噬細胞和淋巴細胞介導的炎癥免疫反應，抑制多種促炎細胞因子的生成，還可拮抗NF-κB對基因轉錄的活性［8］。研究表明，IL-10水平與胰島素敏感性改善相關［9］，而IL-10水平下降與IR發(fā)生有關［10］。IL-10可以通過胰島素受體底物激活PI3K通路，并可以弱化腫瘤壞死因子（TNF）-α在脂肪細胞中的胰島素受體信號，從而拮抗其毒害效應。本研究結果顯示各IH組和CH組脂肪細胞的上清內(nèi)IL-10水平的表達較各自對照組明顯降低，這與既往研究相符。Li等［8］研究顯示IH使大鼠血清IL-10水平下降，且在6周后達到最低點。另有研究表明，OSA患者IL-10水平降低，且其表達與OSA的嚴重程度呈負相關［11］。研究顯示，脂聯(lián)素誘導IL-10的表達，在OSA患者或動物及細胞IH模型中均已證明脂聯(lián)素水平是下降的［12］。本研究中各IH組中IL-10水平均較對照組下降，筆者推測IH通過下調脂聯(lián)素水平，使IL-10在3T3-L1脂肪細胞表達水平降低。本研究還發(fā)現(xiàn)IH3組較IH1、IH4組IL-10的水平明顯降低。這與IH對IL-10的影響主要發(fā)生于再氧合階段有關，IH3組比IH1、IH2組的再氧合時限長，炎癥反應強，對細胞炎性損傷程度嚴重。而IL-10的水平并非隨著再氧合時限的延長進一步降低，隨著再氧合時限的延長，細胞功能有了恢復的時間，炎癥反應反而減輕，故IH3組IL-10水平低于IH4組。

Fig.2The levels of visfatin protein in different groups圖2　脂肪細胞內(nèi)脂素的蛋白表達水平

Fig.3The levels of NF-κB p65 protein in different groups圖3　脂肪細胞核NF-κB p65的蛋白表達水平

3.3IH對脂肪細胞內(nèi)脂素分泌的影響內(nèi)脂素既是脂肪因子也是炎癥因子，在IR狀態(tài)下，其在血清中水平是升高的［13］。內(nèi)脂素不僅可以通過類脂肪因子途徑增加胰島素的分泌，而且通過細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2和PI3K/蛋白激酶B（Akt）介導的通路，刺激β細胞增殖并抑制β細胞凋亡［14］，說明內(nèi)脂素對β細胞有潛在的積極影響。其與胰島素受體結合，誘導胰島素受體、胰島素受體底物（IRS）-1和IRS-2的酪氨酸殘基磷酸化，促進PI3K和IRS-1及IRS-2的結合；增加Akt和絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，表明內(nèi)脂素具有類似胰島素的降血糖作用［15］。本實驗結果顯示，與SC1、SC2、CC組相比，IH1、IH2和CH組脂肪細胞上清液內(nèi)脂素蛋白和mRNA水平均明顯增加。內(nèi)脂素mRNA的表達通過缺氧誘導的HIF-1α途徑激活，且HIF-1α誘導內(nèi)脂素基因調控［16］。IH使NF-κB活性增高，從而促進內(nèi)脂素的表達。ROS是OSA模式下IH導致內(nèi)脂素生成增多的另一個原因。IR本身也是促進內(nèi)脂素分泌的因素，當發(fā)生IR時，由于細胞感知到的胰島素水平下降，生成更多的內(nèi)脂素。因此，OSA模式下IH可以通過HIF-1α、NF-κB和JNK通路、糖皮質激素、炎癥反應及氧化應激等途徑促進內(nèi)脂素的分泌。然而，在本研究中，IH3、IH4組蛋白及mRNA水平與其各自對照組無差異；考慮此時IH程度重，細胞炎癥損害嚴重，上述促進內(nèi)脂素生成的途徑不能被激活有關。

綜上，OSA模式IH與致炎因子的增加和抑炎因子的減少相關，IH作為OSA的主要病生理特征，可能是脂肪細胞炎癥反應的基礎，并參與OSA患者IR的發(fā)生。本研究在細胞水平討論了IH所致炎癥因子和脂肪因子的改變，為研究IH暴露后代謝和炎癥改變的病生理分子機制提供了較好的實驗依據(jù)。

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（2016-01-29收稿2016-06-23修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of different degrees of intermittent hypoxia on NF-κB，IL-10 and visfatin in 3T3-L1 adipocytes

HAN Miaomiao1，ZHOU Qin2，F(xiàn)ENG Jing3，NIU Wenyan4，HE Qing2△
1 Department of Endocrinology，Tianjin Xiqing Hospital，Tianjin 300380，China；2 Department of Endocrinology，3 Department of Respiratory Medicine，General Hospital of Tianjin Medical University；4 Tianjin Medical University△

E-mail：Hech69@hotmail.com

ObjectiveTo determine levels of nuclear factor（NF）-κB，interleukin（IL）-10，and visfatin in adipocytes treated by different degrees of intermittent hypoxia（IH），and to investigate the mechanism of IH leading to insulin resistance（IR）.MethodsThe cell model of intermittent hypoxia/re-oxygenation（IH/ROX）in obstructive sleep apnea（OSA）was established.Differentiation mature 3T3-L1 adipocytes，were randomly divided into 10 groups including four differentfrequency intermittent hypoxia groups（IH1-4，fixed intermittent hypoxia scheme for 1.5%O245 s and then re-oxygen 21%O2for 2 min 15 s，4 min 15 s，5 min 45 s and 8 min 45 s，60 times circulation），and their normal oxygen control groups（SC1-4，instead each IH group 1.5%O2to 21%O2，the rest groups were treated as same as IH group），continuous hypoxia group（CH，10%O2for 6 h）and normal oxygen control group（CC，21%O2for 6 h）.ELISA method was used to determine the levels of IL-10 and visfatin in the supematant of adipocytes.Western blot method was used to determine the protein levels of NF-κB p65 and visfatin.Real-time PCR method was used to determine the mRNA levels of IL-10 and visfatin.ResultsThe protein and mRNA expressions of IL-10 were significantly lower in IH group and CH group than those of control groups（P＜0.01）. The levels of NF-κB p65 protein were significantly increased in IH group and CH group than those of control group.The protein and mRNA expressions of visfatin were significantly higher in IH1，IH2and CH groups than those of control group（P＜0.01）.ConclusionAs a prominent feature of OSA pathophysiology，IH may take part in insulin resistance of OSA patients by abnormally secreting NF-κB，IL-10 and visfatin in adipocytes.

sleep apnea，obstructive；intermittent hypoxia；insulin resistance；NF-kappa B；nicotinamide phosphoribo?syltransferase；interleukin-10；visfatin

R587，R563

A

10.11958/20160041

1天津市西青醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編300380）；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院內(nèi)分泌科，3呼吸科；4天津醫(yī)科大學

韓苗苗（1987），女，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要從事糖尿病研究

E-mail:Hech69@hotmail.com