丹皮酚對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響

李前寬，鄭瀟然，龔明玉，范彥芳，屈敬陽(yáng)，周曉慧

· 論著 ·

丹皮酚對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響

李前寬1，鄭瀟然1，龔明玉1，范彥芳1，屈敬陽(yáng)1，周曉慧1

目的 討論丹皮酚對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響。方法 選擇健康雄性SD大鼠46只，所有大鼠隨機(jī)分為6組，正常組（7只）、模型組（8只），低劑量、中劑量、高劑量組各8只，辛伐他汀組（陽(yáng)性對(duì)照）7只。正常組普通飼料喂養(yǎng)，生理鹽水灌胃，連續(xù)8周；模型組：高脂飲食25 g/只/d飼喂，連續(xù)8周，以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)8周；低劑量、中劑量、高劑量組：大鼠高脂飲食25 g/只/d，連續(xù)8周，然后給予不同劑量（低、中、高）的丹皮酚（30、60、120 mg/kg·d）灌胃，連續(xù)8周；辛伐他汀組：高脂飲食25 g/只/d，連續(xù)8周，然后辛伐他汀10 mg/kg·d灌胃，連續(xù)8周。RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）表達(dá)量。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C以及LDL-C/HDL-C比值升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組各血脂指標(biāo)均改善，同時(shí)，高劑量組的各血脂指標(biāo)也改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。中劑量組較模型組TC和LDL-C/HDL-C比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。模型組較對(duì)照組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)均降低，丹皮酚干預(yù)的高劑量組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 高劑量丹皮酚明顯改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂，降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)趨化因子的表達(dá)，同時(shí)降低冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。

丹皮酚；冠狀動(dòng)脈粥樣硬化；趨化因子；炎癥

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重的心臟疾病，若不及早治療，最終可導(dǎo)致心室重構(gòu)或心肌纖維化，嚴(yán)重影響心臟功能和預(yù)后［1］。多種因素導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，針對(duì)可控因素，采用多種途徑干預(yù)，對(duì)于改善預(yù)后非常重要。丹皮酚別稱牡丹酚，具有非常廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等［2］。本研究中，觀察丹皮酚對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響，分析其作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康雄性SD大鼠46只，體重180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK（京）2009-0004。丹皮酚片（廣西億康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H45021119），總RNA提取試劑盒（寶生物工程大連有限公司）、PCR引物由上海生物工程有限公司合成。DYY-8C 型電泳儀（北京市六一儀器廠），2K15 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Sigma公司），全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（美國(guó)Cepheid公司）。

1.2模型制作及分組 所有大鼠分為6組，正常組（7只）、模型組（8只），低劑量、中劑量、高劑量組各8只，辛伐他汀組（陽(yáng)性對(duì)照）7只。正常組：采用普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)6周，與藥物等體積的生理鹽水灌胃；模型組：高脂飲食25 g/只/d飼喂，連續(xù)6周，然后以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)6周；低劑量、中劑量、高劑量組：大鼠高脂飲食25 g/只/d，連續(xù)6周，然后給予不同劑量（低、中、高）的丹皮酚（30、60、120 mg/kg·d）灌胃，連用6周；辛伐他汀組：大鼠給予高脂飲食25 g/只/d，連續(xù)6周，辛伐他汀10 mg/kg·d灌胃，連用6周。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化模型成功的標(biāo)準(zhǔn)［3］：HE染色病變處內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜明顯增厚，纖維化，斑塊內(nèi)含有大量泡沫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維斑塊及鈣化。

1.3血脂水平檢測(cè) 最后一次給藥后禁食不禁水12 h，稱重并麻醉7組大鼠，麻醉后取腹主動(dòng)脈血，并以3000 r/min離心取上層血清，置入全自動(dòng)生化分析儀，按照儀器及試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)血脂指標(biāo)，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，計(jì)算LDL-C/ HDL-C。

1.4檢測(cè)粘附分子和單核細(xì)胞趨化因子表達(dá)量取主動(dòng)脈組織后采用takara試劑提取總RNA，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）表達(dá)量檢測(cè)方法為RT-PCR，反應(yīng)條件為［4］：變性均在94℃下完成，退火條件60～62℃；延伸在72℃下1 min，完成30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；取5 μl產(chǎn)物，在160V電壓條件下瓊脂糖凝膠電泳2 h，紫外透射儀觀察并攝取圖像。定量分析軟件為Quantity One，采用目的基因條帶的光密度與GAPDH基因條帶光密度的比值表示目的基因mRNA表達(dá)量［5］。以下為各分子的引物：GAPDHFP：5’GGCTGAGAATGGGAAGCTGGTC AT3，GAPDHRP：5’CAGCCTTCTCCATGGTGG TGAAGA3；

I C A M I-1 F P：5’C C T T A G G A A G G TGTGATATCCGG3， ICAMI-1RP：5’AGGTGGTCACCCATGCTGGTGCT3；VCAM-1FP：5’ACACCTCCCCCAAGAATACAG 3，VCAM-1RP：5’GCTCATCCTCAACACCCACAG3； MCP-1FP：5’CAATGAGTCGGCTGGAGAAC3，MCP-1RP：5’CAGAAGTGCTTGAGGTGGTTG3。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血脂水平比較 與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C以及LDL-C/HDL-C比值升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組各血脂指標(biāo)均改善，同時(shí)，高劑量組的各血脂指標(biāo)也改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。中劑量組較模型組TC和LDL-C/HDL-C比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

表1　各組大鼠血脂水平比較

2.2多種細(xì)胞因子表達(dá)量比較 模型組較對(duì)照組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與模型組比較，辛伐他汀組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)均降低，丹皮酚干預(yù)的高劑量組ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2，圖1）。

表2　各組中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)量比較

圖1　ICAM-1、VCAM-1、MCP-1在各組大鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)（A：正常組；B：模型組；C：辛伐他汀組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組）

3　討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，其病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化，其導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的原因至今無(wú)定論［6］，經(jīng)研究可知，脂質(zhì)代謝、免疫功能障礙、炎癥反應(yīng)及內(nèi)膜損傷等均可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化［7］。單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中占據(jù)重要地位［8］，以上細(xì)胞能夠分泌多種炎癥因子，促使平滑肌細(xì)胞凋亡，形成惡性循環(huán)［9］。

本研究旨在探討丹皮酚對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響，其中模型組較正常組大鼠TC、TG、LDL-C以及LDL-C/HDL-C均有明顯升高，提示模型成功。TC、TG的升高加快斑塊的形成，加重病情，LDL-C是損傷血管內(nèi)膜的重要物質(zhì)，當(dāng)沉積在血管內(nèi)膜上后，經(jīng)自由基氧化后加快血栓的形成［10］，HDL-C在膽固醇從血液進(jìn)入肝臟發(fā)揮重要作用，可維持細(xì)胞內(nèi)外膽固醇的平衡，預(yù)防膽固醇升高甚至冠狀動(dòng)脈粥樣硬化［11-13］。丹皮酚及辛伐他汀干預(yù)后，較模型組大鼠TC、TG、LDL-C明顯下降，LDL-C/HDL-C比例下降，表明丹皮酚具有調(diào)節(jié)血脂的作用。同時(shí)，丹皮酚和辛伐他汀降低ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達(dá)，可預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，丹皮酚可改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血脂，預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化，但其對(duì)人類心臟的作用仍需進(jìn)一步研究。

［1］ 周曉慧，趙靜怡，張樹峰，等. 丹皮酚通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)MMP-9的表達(dá)改善心梗后大鼠的心室重構(gòu)［J］. 中成藥，2014，36（12）：2599-602.

［2］ 騫秀芳，胡常菊，劉丹，等. 丹皮酚對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠脂質(zhì)代謝和核因子-κB的影響［J］. 中國(guó)藥師，2014，17（9）：1441-3.

［3］ 曹軍平，徐麗，馬毅，等. 丹皮酚對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠CRP的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（8）：991-2.

［4］ 趙靜怡，董紅玉，周曉慧，等. 丹皮酚對(duì)急性心肌梗死大鼠心室重構(gòu)及NF-κBp65、IL-1mRNA表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（15）：177-80.

［5］ 張金艷，趙樂(lè)，余學(xué)釗，等. 丹皮酚對(duì)健康和高血脂大鼠腎動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈的舒張作用［J］. 中國(guó)新藥雜志，2013，22（20）：2414-7.

［6］ 趙靜怡，張樹峰，徐倩，等. 丹皮酚對(duì)大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)及心功能的影響［J］. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，30（3）：194-6.

［7］ 周曉慧，任立群，劉維朝，等. 丹皮酚抑制心肌梗死家兔心肌TLR4信號(hào)通路改善心室重構(gòu)［J］. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（21）：4690-2.［8］ 時(shí)召平，周曉慧，徐倩，等. 丹皮酚對(duì)大鼠急性心肌梗死所致心肌纖維化的影響及機(jī)制［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（9）：150-5.

［9］ 顧媛媛，周曉慧，徐倩，等. 丹皮酚對(duì)急性心肌梗死后心室重構(gòu)模型大鼠RAS的影響［J］. 天津醫(yī)藥，2015，43（5）：470-3.

［10］ 周曉慧，牛成偉，曹凱，等. 丹皮酚通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)高脂血清誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2011，27（2）：249-53.

［11］ 時(shí)召平，周曉慧，徐倩，等. 丹皮酚對(duì)急性心肌梗死大鼠Smad2，Smad3，Smad7 mRNA含量表達(dá)的影響［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（2）：146-50.

［12］ 董國(guó)菊. 中醫(yī)藥干預(yù)急性心肌梗死后心室重構(gòu)的機(jī)理研究進(jìn)展［J］. 環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（10）：783-7.

［13］ 王媛，楊清，羅智，等. 年患者血清高密度脂蛋白膽固醇水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性研究［J］. 中國(guó)醫(yī)藥，2015，10（11）：1574-6.

本文編輯：姚雪莉

Influence of paeonol on coronary atherosclerosis

LI Qian-kuan*， ZHENG Xiao-ran， GONG Ming-yu， FAN Yan-fang， QU Jing-yang， ZHOU Xiao-hui.*Chengde Medical College， Chengde 067000， China.

ZHOU Xiao-hui， E-mail： zxh5055@sina.com

Objective To discuss the influence of paeonol on coronary atherosclerosis in rats. Methods Male healthy SD rats （n=46） were chosen and randomly divided into 6 groups： normal group （normal forage and normal saline solution for 8 w， n=7）， model group （25 g/rat/d of high-fat forage for 8 w and normal saline solution for 8 w， n=8）， low-dose group （25 g/rat/d of high-fat forage for 8 w and 30 mg/kg·d of paeonol for 8 w， n=8）， middose group （25 g/rat/d of high-fat forage for 8 w and 60 mg/kg·d of paeonol for 8 w， n=8）， high-dose group （25 g/rat/d of high-fat forage for 8 w and 120 mg/kg·d of paeonol for 8 w， n=8） and control group （25 g/rat/d of highfat forage for 8 w and 10 mg/kg·d of simvatatin for 8 w， n=7）. The expressions of GAPDH， intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1）， vascular adhesion molecule-1 （VCAM-1） and monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1）were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） and agarose gel electrophoresis. The levels of total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low-density lipoprotein-cholesterol （LDL-C）and high-density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） were detected by using automatic biochemical analyzer. Results Compared with normal group， the levels of TC， TG and LDL-C and ratio of LDL-C to HDL-C increased， and level of HDL-C decreased in model group （all P＜0.05）. Compared with model group， all blood fat indexes were improved in control group and in high-dose group at the same time （all P＜0.05）. The level of TC and ratio of LDL-C to HDL-C decreased in mid-dose group compared with model group （all P＜0.05）. The expressions of ICAM-1，VCAM-1 and MCP-1 increased in model group compared with control group （all P＜0.05）. Compared with model group， the expressions of ICAM-1， VCAM-1 and MCP-1 decreased in control group and high-dose group （all P＜0.05）. Conclusion Paeonol in high dose can significantly improve blood fat indexes， reduce the expressions of chemotactic factors related to coronary atherosclerosis and decrease risk of coronary atherosclerosis.

Paeonol； Coronary atherosclerosis； Chemotactic factors； Inflammation

R543.5

A

1674-4055（2016）09-1037-03

河北省教育廳青年基金資助項(xiàng)目（Q2012015）；河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（20110543）

1067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院

周曉慧，E-mail：zxh5055@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.09.04