金櫻子中總黃酮的超聲提取及抗氧化活性分析

劉焱 張延魯 覃克鳳

摘要：研究貴州遵義地區(qū)金櫻子（Rosa laevigata Mickx.）中總黃酮的超聲提取工藝及抗氧化活性。以金櫻子中總黃酮的提取率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計試驗對超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過豬油抗氧化試驗、羥基自由基清除效果研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，金櫻子中總黃酮的最佳提取工藝條件為物料比1∶20（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提溫度70 ℃，超聲提取時間40 min，超聲功率240 W，在此條件下總黃酮提取率為0.632%。金櫻子中總黃酮表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，且與質(zhì)量濃度成正相關(guān)，雖抗氧化能力小于維生素C，仍不失為一種較好的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：金櫻子（Rosa laevigata Mickx.）；總黃酮；超聲波提??；抗氧化

中圖分類號：R282；Q946.91 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1256-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.042

Analysis of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from Rosa laevigata Mickx. and Antioxidant Activities

LIU Yan，ZHANG Yan-lu，QIN Ke-feng

（College of Resources and Environment，Zunyi Normal College， Zunyi 563002，Guizhou， China）

Abstract： Ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Rosa laevigata Mickx. in Zunyi area， the orthogonal design method was used for the optimization of ultrasonic extraction. The antioxidant activities of extracts were studied through the scavenging effects of lard，hydroxyl free radical. The results showed that the optimum extraction conditions were the ratio of material to liquid 1∶20（g/mL）， ethanol concentration 60%， extraction temperature 70 ℃， the ultrasonic power 240 W and extraction time 40 min. Then， the extraction rate of total flavonoids from Rosa laevigata Mickx. reached 0.632%. Under this best condition，the total flavonoids from Rosa laevigata Mickx. indicated strong antioxidant activities， but its antioxidant abilities was smaller than VC， and the antioxidant activity and the density of the flavonoids had a positive correlation. Rosa laevigata Mickx. is a very good nature antioxidant.

Key words： Rosa laevigata Mickx.；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant

金櫻子（Rosa laevigata Mickx.）別名糖罐子、刺頭、倒掛金鉤，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南、江西、浙江等地，均為野生[1，2]。在中醫(yī)上主要用于澀腸止瀉及固精縮尿等多種疾病的治療[3，4]，具有抗氧化、抗癌、增強機體免疫力等生理功能及藥理作用[5，6]。金櫻子的果實含20余種氨基酸及多種微量元素，尤其是鋅、硒、鐵等的含量很高[7]。金櫻子中富含維生素C、還原糖、檸檬酸、蘋果酸等幾十種生理活性物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗心律失常等藥用保健作用[7，8]。由于其果實具有藥食同源性，民間將其作為天然保健品。因此，具有較大的開發(fā)潛能。

傳統(tǒng)的總黃酮提取方法有煎煮法、回流提取、索氏提取、浸漬法等。超聲技術(shù)的高頻振動及空化效應(yīng)，可破壞細(xì)胞組織從而強化提取效果，具有提取時間短、效率高等優(yōu)點。本試驗采用超聲波輔助提取金櫻子中總黃酮，然后對其進(jìn)行抗氧化分析，進(jìn)一步探索其內(nèi)在的抗氧化能力，為金櫻子的開發(fā)利用提供評估依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

金櫻子，2013年11月購于貴州省遵義市；蘆丁（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SG5200HD型超聲波提取儀（上海冠特超聲儀器有限公司）；1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 金櫻子總黃酮測定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，測定金櫻子中總黃酮含量， 添加Al3+試劑， 同時控制pH，運用黃酮可以與Al3+試劑形成穩(wěn)定的絡(luò)合物的原理，可以在可見區(qū)范圍內(nèi)得到較為穩(wěn)定的特征吸收波譜。配制不同濃度的蘆丁對其進(jìn)行紫外-可見光譜全掃描，確定最大吸收波長為440 nm，繪制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素預(yù)試驗結(jié)果[9]，選正交試驗5因素4水平進(jìn)行正交試驗。即選擇物料比（A）（金櫻子∶乙醇，m∶V，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、浸提溫度（C）、浸提時間（D）、超聲功率（E）5個因素進(jìn)行正交試驗，每個因素設(shè)4個水平（表1），采用L16（45）進(jìn)行正交試驗。

1.3 金櫻子總黃酮抗氧化能力測定

1.3.1 金櫻子總黃酮在豬油中的抗氧化能力測定 取金櫻子總黃酮濃縮液1.5、3.5、5.5、6.88 mL，放入25 mL容量瓶中配制成不同濃度溶液，取4 mL與2.101 3 g 的豬油樣品置入250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-乙酸混合液，使樣品完全溶解。添加1.00 mL 預(yù)先配制的飽和KI溶液，密閉，將其輕輕充分搖勻，隨后將其放在暗處靜置3 min， 取出后加100 mL水，輕輕搖勻。然后立即用0.019 49 mol/L Na2S2O3溶液滴定，當(dāng)呈淡黃色時，加入1 mL 淀粉指示劑，繼續(xù)滴定，直到藍(lán)色消失為止。取與上述相同量的三氯甲烷-乙酸混合液、KI溶液、水，進(jìn)行同一操作步驟， 作為空白試驗。

樣品的過氧化值 （POV）計算公式如下[10]：

POV=■×1 000

式中，POV為樣品的過氧化值（mmol/kg）；V1 為樣品消耗Na2S2O3體積（mL）；V2為空白試驗消耗Na2S2O3體積（mL）；M為Na2S2O3的物質(zhì)的量濃度（mol/L）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.2 金櫻子總黃酮對羥自由基的清除率 取金櫻子總黃酮濃縮液2、4、6、8 mL，放入50 mL容量瓶中配制成不同濃度溶液，取1 mL該溶液，加25 mL 2 mmol/L FeSO4溶液，25 mL 6 mmol/L H2O2溶液于150 mL的錐形瓶中，混合均勻后加入75 mL 6 mmol/L預(yù)先配制的水楊酸溶液，37 ℃恒溫水浴，充分反應(yīng)15 min，測定波長為510 nm 下空白對照的吸光度（A0），并由該測定溶液體系中取24 mL于25 mL的比色管中，再加入1 mL不同濃度濃縮液，37 ℃的水浴中反應(yīng) 15 min，隨后將其通過室溫水浴進(jìn)行冷卻，放置5 min，測定波長為510 nm下該樣品的吸光度（Ax），并以抗壞血酸作為效果對照。每個試驗組重復(fù)3次，求其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果表明，吸收峰與蘆丁濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.010 11+27.037 35C，相關(guān)系數(shù)R=0.994 25。

2.2 金櫻子中總黃酮超聲提取的正交試驗結(jié)果

為了確定在多因素條件下超聲輔助提取金櫻子中總黃酮的最佳工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇合適的參數(shù)范圍，對物料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、浸提溫度（C）、浸提時間（D）、超聲功率（E），采用L16（45）進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化最佳提取工藝，正交試驗結(jié)果見表2。

由表2所知，試驗中各因素對超聲輔助提取金櫻子總黃酮的影響大小依次為物料比、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時間?？芍?，貴州遵義地區(qū)金櫻子中總黃酮的最佳提取工藝條件為物料比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，浸提溫度為70 ℃，超聲提取時間為40 min，超聲功率為240 W，在此條件下總黃酮提取率為0.632%。

2.3 金櫻子總黃酮對豬油的抗氧化效果

金櫻子總黃酮對豬油的抗氧化效果如圖1所示。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著金櫻子總黃酮濃縮液添加量的增大，其抗氧化效果越好。添加不同濃度總黃酮濃縮液后，與對照相比，各樣品的POV值下降，表現(xiàn)出明顯的降低豬油中過氧化值的作用， 這與文獻(xiàn)[11]中用氯化亞錫降低POV的效果相似，即金櫻子總黃酮濃縮液添加到豬油后，不僅抑制豬油的自動氧化，而且能很好地去除豬油中已有的過氧化物，從而降低POV。

2.4 金櫻子總黃酮對羥自由基的清除率

羥自由基是目前已知具有最強氧化性的氧化劑，對生物體中細(xì)胞和組織的破壞作用最大。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：H2O2+Fe2+=·OH+OH-+Fe3+，水楊酸能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm波長處有強吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有捕捉·OH功能的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色物質(zhì)產(chǎn)物生成量減少。

由圖2可知，金櫻子總黃酮對·OH均有一定的清除作用。當(dāng)在0.004～0.018 mg/mL范圍內(nèi)，羥自由基清除率與總黃酮濃度呈良好的線性關(guān)系。在本試驗測定的濃度范圍內(nèi)，金櫻子總黃酮能夠很好地清除羥自由基，但該清除作用還是低于維生素C的清除作用。

3 小結(jié)

超聲波輔助提取金櫻子中總黃酮可降低提取成本，節(jié)省提取時間。通過單因素試驗和正交試驗，以乙醇為提取溶劑，超聲輔助提取貴州遵義地區(qū)金櫻子中總黃酮，最佳提取工藝條件為物料比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提溫度70 ℃，超聲提取時間40 min，超聲功率240 W，在此條件下總黃酮提取率為0.632%。測定所提取總黃酮在豬油中的抗氧化作用及對羥自由基的清除作用，將金櫻子和維生素C抗氧化能力進(jìn)行比較研究可知，在所測定的濃度范圍內(nèi)，金櫻子總黃酮對·OH具有明顯的清除作用，但弱于維生素C。試驗結(jié)果證明，金櫻子總黃酮具有較好的抗氧化能力，是一種具有潛在開發(fā)價值的天然抗氧化劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000.

[2] 林芳花，彭永宏，曾令達(dá).金櫻子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J].廣州化工，2010，38（4）：5-8.

[3] 江明珠，顏 輝，聞 燕，等.草莓金櫻子復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝研究[J].中國釀造，2011（12）：189-192.

[4] 肖凱軍，劉曉紅.金櫻子果實的化學(xué)成分及其應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志，2006，16（4）：1-3.

[5] 王 健.金櫻子的藥理作用及黃酮的提取方法[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2013，10（22）：243.

[6] 劉軍海，黃寶旭，劉玉剛.金櫻子總黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（11）：51-56.

[7] 劉 焱，李 麗，高智席，等.藥食同源野生果金櫻子的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（14）：7276-7280，7284.

[8] 劉學(xué)貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34（11）：392-398.

[9] 劉 焱，付 玉，李 麗，等.正交試驗法優(yōu)選金櫻子中總黃酮的提取工藝[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（2）：86-87.

[10] 陳乃富.蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（11）：63-66.

[11] 楊繼生，倪永全.降低油脂中過氧化值方法的研究[J].化學(xué)世界，2000，41（10）：526-528.