姜黃素對草魚急性肝損傷的保護作用研究

喻運珍　余少梅　熊文靜　張生元　徐志強　鄭翠華　周汝珍

摘要：以CCl4誘導(dǎo)的草魚（Ctenopharyngodon idellus）急性肝損傷模型為基礎(chǔ)，考察姜黃素對肝臟組織的保護作用。對草魚腹腔注射不同劑量CCl4-橄欖油后，分別于不同時間點測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，確定CCl4-橄欖油最佳注射劑量和作用時間；以建立的草魚急性肝損傷模型為基礎(chǔ)，采用不同濃度姜黃素（5、25、75、150、300 mg/kg）進行灌胃給藥，觀察草魚血清和肝臟組織中相關(guān)生化指標變化情況。結(jié)果表明，用15%的CCl4-橄欖油腹腔注射（劑量為0.1 mL/10 g魚體重）24 h后，使草魚血清中GPT、GOT水平升高（P<0.05）；同時，150 mg/kg姜黃素能顯著（P<0.05）抑制血清中GOT和GPT水平的升高。姜黃素對CCl4誘導(dǎo)的草魚肝組織損傷具有保護作用。

關(guān)鍵詞：草魚（Ctenopharyngodon idellus）；CCl4；姜黃素；肝損傷

中圖分類號：S943 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1514-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.038

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是中國“四大家魚”之一，是淡水養(yǎng)殖的主要品種，隸屬于硬骨魚類鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬。隨著魚類集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度的迅速提高、人工配合飼料大量投喂、不規(guī)范藥物的使用、水體環(huán)境的日趨惡化、飼料中營養(yǎng)成分的失衡與缺失以及飼料中存在有毒物質(zhì)等不利影響因素越來越多，造成養(yǎng)殖魚類代謝失衡，特別是對魚類肝臟損害極為嚴重[1，2]。在魚類中，肝臟是中間代謝的主要器官，也是重要的營養(yǎng)儲存器官，易受多種病原體入侵，因此肝臟是毒理學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科研究的主要對象之一[3，4]。

中草藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中日益受到重視，其安全、無殘留、毒副作用小，不會產(chǎn)生耐藥性，目前漁用的保肝護肝國家標準藥物只有肝膽利康散[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗HIV、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂和抗老年癡呆等作用[6-8]。目前關(guān)于姜黃素治療各種原因引起的肝損傷的研究較多，姜黃素對由CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝細胞毒性有保護作用[9]，能顯著降低血清中轉(zhuǎn)氨酶活性，減輕肝細胞脂肪貯積、脂肪變性和肝臟炎性細胞浸潤等，保護肝細胞[10-12]，可以減輕由肝毒劑誘導(dǎo)肝臟病變產(chǎn)生的膠原纖維和細胞炎癥因子，防治或減輕肝纖維化，預(yù)防腫瘤細胞增殖而抑制肝臟腫瘤生成[13]。然而將姜黃素用于水產(chǎn)領(lǐng)域的保肝作用研究少有報道，本研究旨在探索姜黃素對草魚肝損傷的保護作用，為進一步開發(fā)魚類免疫調(diào)節(jié)和保肝中草藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康草魚，體重（50±5.0） g，購于武漢市武湖青魚良種場。

CCl4（分析純）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；不同濃度CCl4-橄欖油溶液（V/V，下同），配成9%、12%、15%、18%及21%的濃度。

羧甲基纖維素鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，肝膽利康散購于武漢市中博水產(chǎn)生物有限公司，姜黃素購于寧波制藥有限公司。肝膽利康散和姜黃素分別用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成不同試驗濃度。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗條件 試驗在循環(huán)過濾水族缸中進行，裝有充分曝氣的自來水，試驗期間pH 6.5～7.2，水溫 24～34 ℃，DO>5 mg/L。

1.2.2 急性肝損傷模型建立 健康草魚隨機分為6組，每組20 尾，禁食24 h后稱體重，按 0.1 mL/10 g腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄欖油溶液，空白對照組注射等體積橄欖油。注射后分別于24、48、72、96 h采樣，每組取魚5尾，尾靜脈采血，4 ℃下靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取部分肝臟組織用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用試劑盒進行測定；固定的肝組織制作石蠟切片并用HE染色。若動物在試驗中死亡，則不進行測定。

1.2.3 姜黃素藥效試驗 草魚隨機分為8個組，每組20尾，即5個試驗組（5、25、75、150、300 mg/kg姜黃素）、陽性對照組（肝膽利康散100 mg/kg）、損傷組及空白對照組，空白對照組和損傷組口灌0.5%羧甲基纖維素鈉，試驗組口灌相應(yīng)劑量藥物，按0.1 mL/10 g口灌給藥1周。禁食24 h后，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄欖油溶液，空白對照組注射等體積橄欖油，24 h后每組取魚5尾，尾靜脈采血，4 ℃下靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取部分肝臟組織用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用試劑盒進行測定；固定的肝組織制作石蠟切片并用HE染色。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝損傷模型的評價

隨機分為6組的草魚，每組 20 尾，禁食 24 h 后稱體重，按 0.1 mL/10 g分別腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄欖油溶液，空白對照組注射等體積橄欖油。18%和21%的CCl4溶液造模組草魚死亡率分別為40%和55%，其他濃度的處理組和對照組均沒出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對9%、12%、15%處理組分別于24、48、72、96 h進行采樣，每組取魚5尾，尾靜脈采血。血清中GPT、GOT活性測定結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，9%、12%、15%的CCl4-橄欖油溶液處理24 h均能引起血清中GPT和GOT顯著升高（P<0.05），其中15%處理組相對其他兩組，升高最為顯著；GPT、GOT 24 h后開始下降，而在48 h時呈上升趨勢。肝組織切片顯微結(jié)構(gòu)見圖2，15%劑量攻毒24 h后組織會出現(xiàn)壞死及空泡，而空白對照組肝細胞分布均勻，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)有壞死和空泡（圖2）。因此，選取15% CCl4攻毒24 h進行造模。

2.2 姜黃素藥效試驗結(jié)果

草魚隨機分為8組，每組20尾，分為空白對照組、損傷組、試驗組5組（5、25、75、150、300 mg/kg姜黃素）及陽性對照組（肝膽利康散100 mg/kg），空白對照組和損傷組口灌0.5%羧甲基纖維素鈉，試驗組口灌相應(yīng)劑量藥物，按0.1 mL/10 g口灌給藥。7 d后禁食24 h，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄欖油溶液，空白對照組注射等體積橄欖油，24 h后每組取魚5尾，尾靜脈采血。從圖3可以看出，隨著姜黃素含量的增加，GOT和GPT活性先逐漸下調(diào)，在150 mg/kg時下調(diào)最大。25 mg/kg姜黃素開始對肝損傷有一定的保護作用，隨著濃度的升高，逐漸增強，150 mg/kg的保護作用達到最大，與損傷組有顯著性差異（P<0.05）。由圖4可以看出，在15%的CCl4-橄欖油溶液攻毒24 h后損傷組出現(xiàn)大量空泡和壞死，而陽性組肝膽利康散修復(fù)能力最好，幾乎沒有壞死及空泡，150 mg/kg姜黃素試驗組只有少量的空泡，說明對肝損傷有一定的保護作用。因此，150 mg/kg姜黃素對草魚肝損傷的保護作用最佳。

3 小結(jié)與討論

魚類肝損傷模型是為了研究魚類肝損傷、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等發(fā)病原因，闡述其發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)機制，防治策略與技術(shù)等而建立的試驗研究模型[14]。利用具有生物學(xué)活性的肝損傷模型，高通量地篩選護肝藥物并探索其作用原理具有重要意義，但是在水產(chǎn)上，魚類保肝藥物篩選模型的研究鮮有報道[15]。其中CCl4是最早、最廣泛應(yīng)用于試驗性肝損傷動物模型的選擇性肝毒性物質(zhì)[16]，其成模率高、重復(fù)性好、易操作，適合誘導(dǎo)動物肝損傷模型[17，18]，CCl4致水產(chǎn)動物肝損傷方面的研究在建鯉中已經(jīng)有報道[19]。CCl4作為典型的肝損傷劑，可通過細胞色素P450作用分解為三氯甲烷自由基（CCl3·）[20]，CCl3·一方面選擇性地損傷小葉中央?yún)^(qū)的肝細胞，另一方面與O2迅速結(jié)合轉(zhuǎn)化為過氧化三氯甲烷自由基（CCl3O2·）[21]，這些自由基通過攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化，損傷肝細胞；大量自由基無法清除，會加重脂質(zhì)過氧化[22]；肝細胞的結(jié)構(gòu)嚴重損傷，導(dǎo)致肝細胞壞死，膜蛋白的合成受阻，胞漿內(nèi)的可溶性酶滲出，導(dǎo)致血清中的GOT、GPT活性升高[23，24]。因此，本研究選擇GOT、GPT等相關(guān)生化指標作為肝（細胞）損傷的指標，進行體內(nèi)急性肝損傷模型的研究，為今后水產(chǎn)保肝藥的研制打下基礎(chǔ)。

藥效試驗結(jié)果表明，25～300 mg/kg姜黃素能顯著抑制 CCl4誘導(dǎo)的血清中GOT、GPT的升高，說明該濃度范圍姜黃素能夠增強肝細胞抵抗磷脂氧化的作用，保護生物膜完整性，且隨著濃度升高，作用增強，在150 mg/kg濃度下達到最大。而300 mg/kg濃度下GOT、GPT活性反而高于150 mg/kg濃度組，反映過高濃度可能不利于魚體健康，下一步將進行姜黃素對魚體毒性的研究。150 mg/kg姜黃素作用效果顯著（P<0.05），作用效果高于國標藥物肝膽利康散，說明姜黃素具有開發(fā)漁用保肝制劑的潛力。

參考文獻：

[1] 黃艷平，楊先樂，湛 嘉，等.水產(chǎn)動物疾病控制的研究和進展[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2004（1）：60-66.

[2] 黃玉玲.我國海水養(yǎng)殖魚類病害研究概況[J].福建水產(chǎn)，2006（4）：50-54.

[3] 王小鶯，胡國良，張彩英，等.保肝護脾液對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2006（2）：10-11.

[4] 李 慧.2，4-二氯苯酸致草魚原代肝臟細胞凋亡及其作用機理研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2013.

[5] 楊敬輝，潘 娟，劉占民.肝膽利康散、L-肉毒堿、膽汁酸對草魚脂肪肝的治療作用的比較[J].中國獸醫(yī)雜志，2013（1）：78-80.

[6] AMMON H P，WAHL M A.Pharmacology of curcuma longa[J]，Planta Med 1991，57：1-7.

[7] AGGARWAL B B， KUMAR A， BHARTI A C. Antieancer Potential of cureumin： Preclinical and clinical studies[J].Anticancer Res，2003，23：363-398.

[8] JOE B，VIJAYKUMAR M，LOKESH B R. Biological properties of curcumin-cellular and molecular mechanisms of action[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2004，44：97-111.

[9] 劉永剛，陳厚昌，趙進軍，等.姜黃素對四氯化碳損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細胞的影響[J].中成藥，2003（3）：50-52.

[10] 劉永剛，謝少玲，李芳君.姜黃素對DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化形成的影響[J].中藥材，2005，28（12）：1094-1096.

[11] 張 瑜，黃秀旺，許建華，等.姜黃素固體分散制劑抗小鼠脂肪肝的實驗研究[J].中國藥業(yè)，2008，17（21）：7-9.

[12] 任永麗，徐宗佩，梁汝圣，等.姜黃素對家鴨脂肪肝模型肝脂與血脂的干預(yù)效果及機制研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（10）：2327-2329.

[13] 何 航，華海嬰，戈士文.姜黃素對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織核因子-κB和過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達的影響[J].中成藥，2009，31（7）：1000-1003.

[14] 向朝林.草魚（Ctenopharyngodon idellus）硫代乙酰胺肝損傷實驗?zāi)Ｐ徒⒓捌鋺?yīng)用研究[D].江蘇蘇州：蘇州大學(xué)，2011.

[15] 曹麗萍，賈 睿，丁煒東，等.建鯉體內(nèi)外急性肝損傷模型的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，39（6）：885-889.

[16] 宋正己.實驗性肝損傷模型的建立和研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2004（5）：278-280.

[17] 姜 露，范 俊.肝損傷動物模型研究進展[J].四川畜牧獸醫(yī)， 2009（4）：22-23.

[18] 宋正己.實驗性肝損傷模型的建立和研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2004（5）：278-280.

[19] KONERI R， BALARAMAN R， FIRODOUS K M V. Hepatoprotective effects of Momordica cymbalaria Fenzl. against carbon tetrachloride induced hepatic injury in rats[J]. Pharmacologyonline，2008，1：365-374.

[20] RECKNAGEL R O，GLENDE J R E， DOLAK J，et al. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity[J]. Pharmacology & Therapeutics，1989，43（1）：139-154.

[21] MITRA S，VENKATARANGANNA M，SUNDARAM R，et al. Effect ofHD-03， a herbal formulation，on the antioxidant defence system in rats[J]. Phytotherapy Research，1998，12（2）：114-117.

[22] ZHOU J F，CAI D，ZHU Y G，et al. A study on relationship of nitric oxide， oxidation， peroxidation， lipoperoxidation with chronic cholecystitis[J]. World J Gastroenterol，2000，6：501-507.

[23] BERRY M N，HALLS H J， GRIVELL M B. Techniques for pharmacological and toxicological studies with isolated hepa-tocyte suspensions [J].Life Sciences，1992，51（1）：1-16.

[24] ROMERO F J，BOSCH-MORELL F，ROMERO M J，et al. Lipid peroxidation products and antioxidants in human disease[J]. Environmental Health Perspectives，1998，106（S5）：1229-1234.