豬流行性腹瀉病毒湖北株的分離鑒定及其s1基因進(jìn)化分析

桂銳 郭銳 田永祥 李文浩 蔡行 段正贏 楊克禮 劉澤文 袁芳艷 劉威 邢崔昱 周丹娜

摘要：豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是豬的腸道傳染病病原，主要引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水，對(duì)一周齡內(nèi)的哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，死亡率可達(dá)50%～100%。利用Vero86細(xì)胞從湖北某豬場(chǎng)腹瀉仔豬小腸病料中分離到一株病毒，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)、序列比對(duì)后確定其為PEDV，命名為HB201503株。設(shè)計(jì)PEDV s1基因的全長擴(kuò)增引物，獲得該株病毒的s1基因全長序列并進(jìn)行了進(jìn)化分析，結(jié)果表明該毒株與近年來在GenBank 登陸的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%～99.2%，與疫苗株CV777相似性較低，僅為91.8%。通過s1基因進(jìn)化樹分析表明HB201503以及近幾年國內(nèi)分離毒株主要集中在第 I 個(gè)亞群，且HB201503株與KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江蘇）同源性較高。此外，s1蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示，HB201503與近幾年分離毒株及疫苗株CV777均在 55-74、157-163位氨基酸出現(xiàn)了連續(xù)4個(gè)以上氨基酸的缺失或替換，而且HB201503株與CV777及近幾年分離毒株相比，還在270-283位氨基酸上出現(xiàn)了1個(gè)氨基酸的缺失和10個(gè)氨基酸的替換。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）；分離鑒定；s1基因；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1506-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.036

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、接觸性、高度傳染性消化道疾病，主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水[1]。各日齡的豬均易感染，其中以哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬發(fā)病率最高，尤其以哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重[2]。20世紀(jì)90年代后期，中國開始大面積使用傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)苗進(jìn)行免疫，取得了很好的效果。然而最近幾年，豬場(chǎng)在廣泛應(yīng)用PED滅活疫苗和弱毒疫苗的同時(shí)，仔豬流行性腹瀉不斷發(fā)生，甚至呈局部暴發(fā)流行，這提示可能PEDV發(fā)生了變異[3]。對(duì)中國最近幾年流行性腹瀉病毒進(jìn)化發(fā)育分析表明，近年來大規(guī)模暴發(fā)流行性腹瀉的原因可能是流行性腹瀉病毒的s基因發(fā)生了變異[4]。PEDV的S蛋白可分為S1（1aa-735aa）區(qū)和S2（736aa-1383aa）區(qū)，其中S1區(qū)包含多個(gè)病毒主要中和表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關(guān)[5]。因此對(duì)PEDV的分離鑒定及s1基因的進(jìn)化分析對(duì)PEDV的防控具有重要意義。本研究從湖北某暴發(fā)仔豬腹瀉的豬場(chǎng)分離到一株P(guān)EDV并命名為HB201503，并對(duì)其s1基因進(jìn)行了克隆測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與最近幾年NCBI登陸的PEDV毒株及疫苗株CV777的s1基因核苷酸序列進(jìn)行了進(jìn)化分析，旨在為豬流行性腹瀉的防控及免疫機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購至康為世紀(jì)科技生物有限公司；pET-30A（+）載體、PEDV檢測(cè)引物參照文獻(xiàn)[6]合成；Vero 86細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司，One-step RT-PCR Super Mix購自北京全式金生物科技有限公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自康為世紀(jì)科技生物有限公司，同源重組酶購自南京唯贊生物科技有限公司，BamH I和Hind Ⅲ快切酶均購自TaKaRa公司，胰蛋白示磷酸鹽肉湯（Tryptose Phosphate Broth）購自上海浩然生物技術(shù)有限公司，氨芐青霉素（Amp）、鏈霉素（Kan）、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶均購自Invitrogen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM培養(yǎng)基（100 U/mL氨芐青霉素，100 μg/mL鏈霉素，5%FBS）對(duì)Vero 86細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.3.2 病毒分離 采集湖北某豬場(chǎng)腹瀉仔豬小腸及內(nèi)容物加入5倍體積的生理鹽水后進(jìn)行組織勻漿并用0.22 μm微孔濾膜過濾后參照文獻(xiàn)[7]中的PEDV分離方法進(jìn)行病毒分離，具體為：將長滿單層Vero 86細(xì)胞的6孔板利用PBS緩沖液（不含鎂離子和鈣離子）洗滌兩遍后每孔加入500 μL處理好的病毒懸液，37 ℃、5%CO2條件下孵育30 min，每孔中加入2 mL的DMEM（100 U/mL氨芐青霉素，100 μg/mL鏈霉素，0.3%TPB）及10 μg/mL的胰酶2 mL。當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)反復(fù)凍融收集病毒懸液。將病毒懸液繼續(xù)按上述方法接種于Vero上，連續(xù)傳代3次后對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的陽性孔進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 上近幾年登陸的PEDV毒株的基因序列，利用DNAman比對(duì)序列后在s1基因序列兩邊的保守區(qū)域利用Primer 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增s1基因序列全長的同源重組引物。引物序列為：上游引物F：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCTCTAATCATTTGGTCAACGTA-3′，下游引物 R：5′-CTCGAGTGCGGCAAGCTTCATTACAAACATA

TGTAACG-3'；檢測(cè)引物序列為：上游P1：5′-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′，下游P2：5′-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3′。

1.3.4 RNA 提取 對(duì)采集的疑似感染PEDV病料加入5倍體積的生理鹽水后進(jìn)行組織勻漿并反復(fù)凍融3次，然后取上清按照說明書進(jìn)行RNA提取。對(duì)于傳代3次后且出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞，利用移液器將其懸浮后反復(fù)凍融3次，離心取上清后按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒說明書提取RNA。

1.3.5 s1基因擴(kuò)增 以提取的RNA為模板利用全式金One-step RT-PCR Super Mix對(duì)s1基因進(jìn)行擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系如下：RNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，2×One-step Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，RNase-free water 17 μL。一步法反應(yīng)條件如下：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。檢測(cè)引物擴(kuò)增體系與s1基因全長擴(kuò)增體系一樣；反應(yīng)條件為退火溫度55 ℃，延伸時(shí)間60 s，其余條件與s1基因全長擴(kuò)增條件一致。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物用于膠回收。

1.3.6 s1基因克隆 依照膠回收試劑盒說明書對(duì)擴(kuò)增s1片段進(jìn)行回收，參照Clone Express II one step kit 說明書將s1片段連接到pET-30A（+）載體上，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α并挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3.7 s1基因序列分析 將測(cè)序結(jié)果利用DNAman生物軟件進(jìn)行拼接后，再利用DNAStar軟件對(duì)HB201503毒株的s1核酸序列與近幾年國內(nèi)外流行的PEDV毒株（表1）和疫苗株CV777的s1核酸序列進(jìn)行序列分析。利用MEGA6.0對(duì)s1核酸序列做系統(tǒng)進(jìn)化分析。最后根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果選擇代表性毒株對(duì)其s1基因氨基酸推導(dǎo)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將連續(xù)傳代3次后出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞毒樣品收集，提取RNA后，利用PEDV檢測(cè)引物對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，RT-PCR電泳結(jié)果（圖1）顯示樣品可擴(kuò)增到663 bp大小的目標(biāo)片段，即分離得到一株P(guān)EDV，命名為HB201503。

2.2 s1基因克隆

以PEDV陽性細(xì)胞毒中提取的RNA為模板，利用設(shè)計(jì)的s1基因全長引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)2.4 kb左右的目的條帶（圖2）。將產(chǎn)物回收用同源重組克隆至pET-30A（+）載體上，提取質(zhì)粒，用BamH I和Hind Ⅲ做雙酶切鑒定，電泳結(jié)果（圖3）顯示分別在2.4 kb和5.2 kb左右出現(xiàn)條帶。

2.3 s1基因序列分析

將s1基因測(cè)序結(jié)果拼接后與疫苗毒株CV777及近幾年在GenBank上登陸的部分PEDV毒株進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)HB201503與其他毒株s1基因相似性在91.4%～99.2%，其中HB201503與KM406183（2014）相似性最高，為99.2%，與日本毒株AB548624（2010）相似性最低，為91.4%，與經(jīng)典毒株CV777相似性較低，為91.8%（圖4）。

2.4 s1基因進(jìn)化分析

將HB201503株的s1核苷酸序列與表1中列舉的核苷酸序列以MEGA6.0軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果顯示PEDV主要被分為兩個(gè)亞群。HB201503位于第I個(gè)亞群，與KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江蘇）親源關(guān)系較近。國內(nèi)外近幾年在NCBI登陸的毒株主要集中在第I個(gè)亞群，而疫苗毒株CV777在第II個(gè)亞群。

2.5 S1蛋白氨基酸序列分析

依據(jù)上述構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，選取JQ979291、KF177258、KJ646591、KM189366、CV777等各分支的代表序列，推導(dǎo)其S1蛋白的氨基酸序列并進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)，結(jié)果（圖6）顯示其變異位置主要發(fā)生在55-74、157-163、270-283這三個(gè)位置。CV777與HB201503及近幾年分離的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出現(xiàn)了連續(xù)4個(gè)以上氨基酸替換或缺失。HB201503與CV777及近幾年分離的其他毒株比較，還在270-283位氨基酸出現(xiàn)了1個(gè)氨基酸缺失和10個(gè)氨基酸的替換。

3 小結(jié)與討論

國內(nèi)目前應(yīng)用于防控PED的疫苗主要是通過將CV777毒株在Vero細(xì)胞上傳代125代后獲得了CV777弱毒株后，在此基礎(chǔ)上研發(fā)而成的弱毒苗[8]。但近年來國內(nèi)出現(xiàn)在免疫疫苗后仍然暴發(fā)PED的情況，這提示毒株有發(fā)生變異的可能。纖突蛋白基因（s）是PEDV結(jié)構(gòu)蛋白中最大的基因，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫性中和抗體的主要免疫蛋白基因[9]，其中S蛋白的S1亞基包含了PEDV主要的中和抗原位點(diǎn)[10]。

本研究通過對(duì)HB201503、CV777以及近幾年在NCBI上登陸的PEDV s1基因序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)近幾年的分離株包括HB201503與疫苗株的s1核苷酸序列相似性均較低，這提示毒株發(fā)生了一定程度上的變異。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，國內(nèi)近幾年分離到的毒株與美國、韓國等國家近年分離到的毒株被類聚到一個(gè)亞群，而這些國家近年來都暴發(fā)流行過PED，提示毒株的變異可能造成了病毒毒力的改變或抗原性的改變。本研究根據(jù)s1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，將HB201503、CV777及其他一些具有代表性的毒株的s1基因推導(dǎo)氨基酸序列做分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CV777與HB201503及近幾年分離的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出現(xiàn)了連續(xù)4個(gè)以上氨基酸替換或缺失，而HB201503與CV777及近幾年分離的其他毒株比較，還在270-283位氨基酸出現(xiàn)了1個(gè)氨基酸的缺失和10個(gè)氨基酸的替換。目前相關(guān)研究證明S1蛋白氨基酸在248-280區(qū)域是一個(gè)能和PEDV顆粒具有高親和力的表位序列[10]。它出現(xiàn)連續(xù)氨基酸的替換可能是導(dǎo)致免疫失敗的一個(gè)原因。與疫苗株CV777相比，近年來在NCBI登陸的其他毒株S1蛋白氨基酸序列在55-74出現(xiàn)連續(xù)4個(gè)氨基酸缺失、在157-163位點(diǎn)出現(xiàn)連續(xù)5個(gè)氨基酸替換對(duì)PEDV在生物學(xué)意義上有何影響，還有待進(jìn)一步研究。

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