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    龍井43號多酚氧化酶同工酶酶學(xué)性質(zhì)研究

    2016-10-19 23:42:06張書芹許雷陳盛虎徐小云黃瑩婕姚燕妮黃友誼
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年6期
    關(guān)鍵詞:同工酶氧化酶電泳

    張書芹 許雷 陳盛虎 徐小云 黃瑩婕 姚燕妮 黃友誼

    摘要:以龍井43號[Camellia sinensis (L.) O. Ktze. cv. Longjing 43]鮮葉為材料,經(jīng)分離純化獲得多酚氧化酶-同工酶(PPO II),對其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,PPO II最適反應(yīng)pH為6.0;抑制劑抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸對PPO II的抑制作用隨抑制劑濃度的增加而增強(qiáng);Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時,PPO II活性最高;PPO II的Km為13.05 mmol/L,vmax為0.019 OD460/min。

    關(guān)鍵詞:龍井43號[Camellia sinensis (L.) O. Ktze. cv. Longjing 43];多酚氧化酶;同工酶;酶學(xué)性質(zhì)

    中圖分類號:S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)06-1487-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.031

    多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO,EC 1.10.3.1)是茶樹生理學(xué)與茶葉產(chǎn)品加工工藝學(xué)中極為重要的生物酶之一,因此一直是人們的研究熱點(diǎn)[1-3]。當(dāng)前對茶樹PPO的研究已進(jìn)入分子水平[4-8],國外已有對茶樹PPO同工酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究的報道[9-14]。然而,國內(nèi)對茶樹PPO性質(zhì)的研究一直停留在粗酶的水平[15,16],除對同工酶譜變化有研究外[17-19],還未見任何分離純化出同工酶及對同工酶性質(zhì)進(jìn)行研究的報道[20]。為此試驗(yàn)以適制綠茶的龍井43號茶樹[Camellia sinensis(L.) O. Ktze. cv. Longjing 43]為材料,分離純化出一個PPO同工酶,并對其部分酶性質(zhì)進(jìn)行了探討,以期推動對茶樹PPO的研究與利用[1,21]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    茶樹鮮葉采摘于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)基地中龍井43號茶樹,鮮葉規(guī)格為1芽2葉,采摘時間為春季,采下后迅速于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存,備用。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 PPO同工酶分離 取龍井43號1芽2葉20 g,用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液4 ℃浸提12 h,然后4 ℃、9 000 r/min離心30 min,取上清液,濾紙過濾后即為粗酶液。將粗酶液用30 %~80 %硫酸銨沉淀,9 000 r/min離心30 min,棄上清液;用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀,3 500 r/min離心30 min,脫鹽3~4次;以上操作均在4 ℃條件下完成。將離子交換劑材料DEAE-Sepharose CL-6B用0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液(4倍體積)進(jìn)行預(yù)平衡,將樣品加入預(yù)平衡柱。加樣完成后,使之與柱材料結(jié)合20 min,然后分別用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L 的NaCl 0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液作為洗脫液,每個濃度梯度洗脫液為3~4倍柱體積,流速60 mL/h。收集峰值洗脫液于超濾離心管中,4 ℃、3 500 r/min離心,脫鹽,濃縮至500 μL左右。各峰值洗脫液分別加入預(yù)平衡(用含有0.1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行預(yù)平衡)Sephadex G-150凝膠柱中,用相同的磷酸鹽緩沖液洗脫,收集各峰值處洗脫液于超濾離心管中,4 ℃、3 500 r/min離心,脫鹽、濃縮至約250 μL左右,4 ℃保存,備用。

    1.2.2 抑制劑對PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液,以鄰苯二酚為底物,分別加入終濃度為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mmol/L的抑制劑反應(yīng)混合液75 μL,按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法,在37 ℃條件下反應(yīng)30 min,加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng),于酶標(biāo)儀460 nm處測其殘留酶活性,結(jié)果以殘留酶活性與未加抑制劑的酶活性相比的百分?jǐn)?shù)表示。抑制劑分別為亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸。

    1.2.3 pH對PPO同工酶活性的影響 配制pH分別為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液,分別取上述緩沖液4 mL和鄰苯二酚1 mL配制反應(yīng)混合液,在10 μL酶液中加入75 μL的反應(yīng)混合液,于37 ℃條件下反應(yīng)30 min,然后加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀460 nm處測其活性。

    1.2.4 底物濃度對PPO同工酶活性的影響 以不同濃度的鄰苯二酚為底物,在10 μL酶液中加入75 μL終濃度分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L的鄰苯二酚反應(yīng)混合液,按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法,在其最適pH的緩沖液中,于37 ℃條件下反應(yīng)30 min,加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀460 nm處測定PPO的活性。用雙倒數(shù)曲線來求取Km值和最大反應(yīng)速率vmax。

    1.2.5 銅離子對PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液,加75 μL終濃度分別為 0、0.25×10-7、0.50×10-7、1.00×10-7、2.00×10-7、3.00×10-7 mol/L的Cu2+反應(yīng)混合液,按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法,在37 ℃條件下反應(yīng)30 min,加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀460 nm處測其活性。

    1.3 蛋白電泳方法

    1.3.1 非變性蛋白電泳方法 PPO同工酶采用非變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳(Native-PAGE)法,濃縮膠濃度為4%,分離膠濃度為7.5%,每孔上樣量為20 μL。預(yù)電壓為穩(wěn)壓50 V,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至穩(wěn)壓110 V,冰浴條件下進(jìn)行電泳。結(jié)束電泳后,將凝膠置于染液(60 mL 1%鄰苯二酚,20 mL 0.6 g/L對苯二胺,20 mL pH 7.2的 0.05 mol/L磷酸緩沖液)中 ,室溫染色30 min后,蛋白膠用去離子水沖洗、浸泡至PPO同工酶帶清晰為止。

    1.3.2 變性蛋白電泳方法 PPO蛋白純度采用變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳((SDS-PAGE)法,濃縮膠濃度為4%,分離膠濃度為12%,每孔上樣量為20 μL。開始電壓為60 V,在溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)到120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底面1 cm左右時結(jié)束電泳,然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色處理。

    1.4 PPO同工酶活性測定方法

    根據(jù)文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法,經(jīng)過改進(jìn)進(jìn)行PPO活性測定。具體步驟如下:用移液槍取10 μL PPO酶液加入酶標(biāo)板,再加入0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液50 μL和75 μL反應(yīng)混合液,在37 ℃條件下反應(yīng)30 min,即刻加入50 μL的6 mol/L尿素溶液終止反應(yīng),然后利用酶標(biāo)儀在460 nm波長處測其吸光值,對照組選用煮沸5~10 min的PPO酶液來代替待測的樣品。反應(yīng)混合液配制方法按0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚=10∶2∶3的比例配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。在試驗(yàn)測定條件下,將以鄰苯二酚為底物的反應(yīng)液吸光值每分鐘增加0.001定義為1個酶活力單位(U)。

    1.5 蛋白濃度測定

    用考馬斯亮藍(lán)法測定PPO蛋白濃度,采用蛋白定量試劑盒測定。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理并作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 茶樹PPO同工酶純化

    茶樹PPO經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行純化后,得到一個單一的同工酶,具體見表1。經(jīng)SDS-PAGE電泳后,結(jié)果見圖1。從圖1-A可見,該同工酶為單一譜帶,可達(dá)到電泳的純度,PPO單鏈的分子量大小約為53 ku。經(jīng)Native-PAGE電泳,結(jié)果見圖1-B,圖1-B顯示有2條同工酶譜帶。依據(jù)該同工酶在離子交換柱層析中洗脫的順序,將其命名為PPO II。經(jīng)檢測,PPO II的比活力為2 325.39 U/mg,純化倍數(shù)約為1.36倍,活性得率為0.07%。

    2.2 抑制劑對PPO II活性的影響

    試驗(yàn)分析了亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸 3種抑制劑對龍井43號茶樹PPO II活性的影響,結(jié)果見圖2。從圖2可見,抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸均對PPO II活性有抑制作用,并且隨著抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)。3種抑制劑對PPO II抑制效果的變化類似;在終濃度0.1 mmol/L之前,3種抑制劑隨濃度的增加,對PPO II活性的抑制效果呈線性增強(qiáng);至0.1 mmol/L濃度時,3種抑制劑抑制了PPO II 65%以上的酶活性;超過0.1 mmol/L濃度后,3種抑制劑抑制PPO II活性的降低程度趨于平緩。在3種抑制劑中,以抗壞血酸的抑制作用略強(qiáng),其次為L-半胱氨酸,亞硫酸鈉最弱;當(dāng)抗壞血酸濃度為0.3 mmol/L時,PPOII殘留的酶活性僅為6.98%。

    2.3 pH對PPO II活性的影響

    試驗(yàn)分析了不同pH對龍井43號茶樹PPO II活性的影響,結(jié)果見圖3。從圖3可知,PPO II呈現(xiàn)兩個活性峰,一個是在pH 6.0,一個是pH 7.6。但以pH 6.0的PPO II活性更高,約為pH 7.6處的2倍,由此可見PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0。

    2.4 底物濃度對PPO II活性的影響

    試驗(yàn)還分析了不同鄰苯二酚濃度對PPO II活性的影響,結(jié)果見圖4。從圖4可以看出,隨著底物濃度的增加,在5~25 mmol/L范圍內(nèi)PPO II活性呈上升趨勢。但隨著底物濃度的進(jìn)一步增加,PPO II活性增加幅度逐漸趨于平緩,且在底物濃度為25 mmol/L時酶活性達(dá)到最大。根據(jù)Lineweaver-Burk方程,得出PPO II的Km為13.05 mmol/L,最大反應(yīng)速率vmax為0.019 OD460/min。

    2.5 銅離子對PPO II活性的影響

    試驗(yàn)分析了添加不同濃度的Cu2+對龍井43號茶樹PPO II活性的影響,結(jié)果見圖5。從圖5可知,Cu2+濃度對PPO II活性呈先促進(jìn)后抑制的作用。隨著Cu2+濃度的增加,PPO II活性升高;當(dāng)Cu2+濃度為0.25×10-7 mol/L時出現(xiàn)一個活性峰,隨后活性隨Cu2+濃度的增加而降低。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到2×10-7 mol/L時,PPO II活性消失,說明同工酶在此Cu2+濃度時完全受到了抑制。

    3 討論

    3.1 PPO II的肽鏈組成形式

    已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物和微生物中的PPO同工酶絕大多數(shù)是同源二聚體,僅少數(shù)是單體或其他組成形式[22]?,F(xiàn)在一般也認(rèn)為茶樹PPO同工酶也是同源二聚體,但也有報道在同一茶樹中的PPO同工酶存在單體、二聚體、三聚體等多種形式[10,11];本試驗(yàn)中暫未對PPO II的肽鏈構(gòu)成進(jìn)行分析。然而在對經(jīng)過分子篩后的PPO II進(jìn)行Native-PAGE電泳染色時,顯示出有2條活性帶,似表明有2個同工酶。但是試驗(yàn)在離子交換后的PPO II分離液進(jìn)行非變性膠顯色時,僅有一條活性帶,變性膠顯示也僅一條帶。這表明茶樹PPO II在分離純化后的保存過程中,酶蛋白相互之間可能會產(chǎn)生一種聚合,但酶活性依然可以保留,這還有待于后續(xù)進(jìn)行PPO II全酶分子量的測定以及分子組成形式分析來驗(yàn)證。

    3.2 PPO II的最適反應(yīng)pH

    已有報道證明茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH為5.6[15,20],但茶樹體內(nèi)也有單一PPO同工酶的最適反應(yīng)pH為5.6左右的報道[10],更有人發(fā)現(xiàn)茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH不在5.6,而是在8.6左右[16,23]。本試驗(yàn)中龍井43號茶樹PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0,除此之外在pH 7.6時會產(chǎn)生另一個活性峰值。而試驗(yàn)在以不同pH的緩沖液進(jìn)行龍井43茶樹PPO蛋白粗提過程中,發(fā)現(xiàn)在酸性和堿性條件下均會產(chǎn)生一個酶活性峰值,但以酸性條件下的峰值更高。令人感興趣的是在酸、堿兩種完全不同的條件下,茶樹PPO催化的機(jī)理是否完全一致、催化產(chǎn)物方面是否會有所不同還有待于后續(xù)試驗(yàn)來比較。

    3.3 銅離子對PPO II的作用

    銅離子是植物PPO催化活性中心的必需因子,已有研究證實(shí)銅離子是茶樹PPO的重要組成部分[11,22]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時酶活性最高,證實(shí)Cu2+可以提高PPO II的活性。而在基因表達(dá)的茶樹PPO蛋白試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度在1.0×10-7 mol/L時PPO活性最高[5]。這表明Cu2+應(yīng)該是茶樹PPO催化所需的因子。

    由于試驗(yàn)僅對分離純化獲得的一個龍井43號茶樹PPO同工酶進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究,局限性不言而喻,還有很多酶學(xué)性質(zhì)方面的問題有待于后續(xù)深入進(jìn)行研究來解決。

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