茄病鐮孢菌對鐵皮石斛的致病性研究

孫惠芳　張發(fā)　劉娜　劉碩然　楊曉燕

摘要：研究茄病鐮孢菌（Fusarium solani）對鐵皮石斛（Dendrobium officinale）的致病性。試驗組通過穿刺接種將茄病鐮孢菌菌懸液接種于鐵皮石斛組培苗及成苗的根部和葉片，植物發(fā)病后從病變植株中分離致病菌，并結(jié)合形態(tài)和分子生物學方法進行鑒定。正常對照組接種無菌水。對照組的鐵皮石斛正常生長，試驗組的鐵皮石斛發(fā)生不同程度的病變，病原菌經(jīng)形態(tài)和分子生物學鑒定顯示為茄病鐮孢菌。茄病鐮孢菌對鐵皮石斛有致病性。

關(guān)鍵詞：茄病鐮孢菌（Fusarium solani）； 鐵皮石斛（Dendrobium officinale）； 致病性

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1441-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.019

茄病鐮孢菌（Fusarium solani）隸屬真菌界半知菌類子囊菌門鐮刀菌屬，是一種廣泛分布的植物病原菌[1，2]，如茄子根腐病[3]、百合枯萎病[4]、薯干腐病[5]、大豆猝死癥[6]等均由茄病鐮孢菌感染引起。該病原菌主要通過傷口感染植物，植物病株表現(xiàn)為葉片萎縮、發(fā)黃，根部軟腐，嚴重的萎蔫枯死，是寄生能力和致病力都較強的土傳病菌[3]。茄病鐮孢菌也是草坪病害的主要病原菌[7]，同時還會引起人類真菌性角膜病[8]。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有很高的藥用價值和觀賞價值，深受人們的喜愛。野生鐵皮石斛遠不能滿足市場需求，因此鐵皮石斛的人工栽培應(yīng)運而生并實現(xiàn)了大規(guī)模種植，但鐵皮石斛在移栽兩年前后容易發(fā)病，若在栽培環(huán)節(jié)失誤，將對鐵皮石斛的產(chǎn)量和藥材質(zhì)量造成嚴重影響，從而造成較大的經(jīng)濟損失[9，10]。加強鐵皮石斛病害的防治，是人工種植鐵皮石斛非常重要的環(huán)節(jié)。真菌病是鐵皮石斛的主要病害之一，目前相關(guān)研究表明棕櫚疫霉菌（Phytophthora palmivora）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和串珠鐮刀菌（F. moniliforme）可引起鐵皮石斛的炭疽病、黑腐病、枯萎病、花枯病等真菌病害[11-15]，但關(guān)于茄病鐮孢菌是否是鐵皮石斛的真菌病害病原菌，尚未見報道。本研究采用人工感染的方法探究茄病鐮孢菌對鐵皮石斛的致病性，以期為鐵皮石斛病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛組培苗由大理大學農(nóng)學與生物科學學院組培室提供。鐵皮石斛成苗購于大理市銀橋鎮(zhèn)鐵皮石斛栽培基地，按每盆2～3株移植后置于室內(nèi)，室溫自然光照條件下培養(yǎng)30 d。茄病鐮孢菌分離自大理白族自治州祥云縣大波那溫泉，中國科學院微生物研究所鑒定，大理大學農(nóng)學與生物科學學院微生物實驗室保存并提供。

1.2 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基的配制參照文獻[16]進行。鐵皮石斛分瓶生根培養(yǎng)基的配制參照文獻[17，18]進行。

1.3 鐵皮石斛組培苗生根培養(yǎng)

在無菌條件下對未生根的鐵皮石斛組培苗進行分瓶。接好后置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，待長出完整葉片和根后，在室溫、自然光照條件下培養(yǎng)15 d可進行感染試驗。

1.4 茄病鐮孢菌菌懸液的制備

茄病鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3 d，用無菌水漂洗菌落表面，制成孢子懸浮液[19]。

1.5 茄病鐮孢菌感染試驗

1.5.1 鐵皮石斛組培苗感染試驗 取鐵皮石斛組培苗10瓶，隨機分為A、B兩組，每組5瓶，A組為試驗組，B組為對照組。在無菌條件下，分別量取5 mL孢子懸浮液穿刺接種于A組組培苗的根部和葉片，對照組接種無菌水。將A、B兩組置于室溫、自然光照條件下隔離培養(yǎng)，定期觀察并記錄鐵皮石斛的生長狀況。

1.5.2 鐵皮石斛成苗感染試驗 取鐵皮石斛成苗10盆，隨機分為C、D兩組，每組5盆，C組為試驗組，D組為對照組。分別量取5 mL孢子懸浮液穿刺接種于C組成苗的根部和葉片，對照組接種無菌水。將C、D兩組置于室溫、自然光照條件下隔離培養(yǎng)，定期觀察并記錄鐵皮石斛的生長狀況。

1.6 病原菌的分離純化

參照文獻[20，21]對病變植株進行病原菌分離純化培養(yǎng)。

1.7 病原菌的形態(tài)鑒定

單孢分離純化培養(yǎng)物接種于PDA平板上，參照相關(guān)文獻進行鏡檢[22]，觀察氣生菌絲、孢子梗和分生孢子等的形態(tài)特征，依據(jù)相關(guān)文獻[1-3，23]進行形態(tài)學鑒定。

1.8 病原菌的分子生物學鑒定

1.8.1 病原菌DNA提取及凝膠電泳 對組培苗和成苗中分離純化后得到的菌落（編號分別為1、2）采用改良的CTAB裂解法提取病原菌總DNA[24]，瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.8.2 PCR擴增 ①引物。采用真菌通用引物[25]，由上海生物工程有限公司合成。上游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。②體系?？傮w系為50 μL，配比為2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL（含10×PCR Buffer、Mg+、dNTP），引物ITS4 2 μL，引物ITS5 2 μL，ddH2O 32.5 μL，DNA Templat 1μL。③擴增條件。94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35次循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[26]。④PCR擴增及產(chǎn)物檢測。對1、2兩個病原樣本總DNA進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.3 PCR產(chǎn)物測序 委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛組培苗感染結(jié)果

試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，鐵皮石斛組培苗接種3 d后，A組培養(yǎng)基表面均長滿菌絲，部分植株的葉片接種部位變黃；6～7 d植株被菌絲布滿，大部分葉片呈褐色及黃色，部分莖干變黃；8～10 d葉片枯黃部分下垂，莖干變黃，部分倒伏；12～15 d后植株死亡，植株表現(xiàn)為葉片枯黃或腐爛，部分莖枯黃、萎蔫甚至腐爛。B組正常。

2.2 鐵皮石斛成苗感染結(jié)果

試驗結(jié)果如圖2所示，鐵皮石斛成苗接種10～15 d后C組葉片接種處出現(xiàn)枯斑，部分葉片卷起，之后葉片似缺水萎蔫，顏色逐漸變黑發(fā)紅直至枯黃脫落，30～60 d后葉片枯黃，部分莖開始腐爛、倒伏，根開始腐爛萎縮。D組正常。

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

將發(fā)病的組培苗和成苗植株內(nèi)分離得到的病原菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌絲生長迅速，30 ℃培養(yǎng)4 d后菌落直徑為52 mm，菌絲無色，分枝、分隔，寬0.5～5.5 μm。 孢子分隔，0～4隔（通常為1隔），孢子大小為7.50～49.00 μm（平均24.76 μm）×1.75～6.00 μm（平均4.22 μm）。分生孢子具小型和大型兩種類型。孢子梗分隔、分枝或不分枝，長7.50～207.00 μm，基部寬1.00～4.50 μm，頂部寬1.50～2.50 μm，分生孢子與孢子梗連接處具刷狀緣，呈掃帚狀。厚垣孢子頂生或串生，大小為5.00～12.50 μm（平均9.11 μm）×5.00～11.50 μm（平均7.74 μm）。其形態(tài)特征與茄病鐮孢菌相同[1-3，23]。

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

對鐵皮石斛病原菌5.8 S rDNA序列進行PCR擴增，得到陽性條帶大小為500～750 bp左右的片段，將病原菌的5.8 S rDNA ITS區(qū)的測序結(jié)果與原始茄病鐮孢菌5.8 S rDNA ITS區(qū)的序列在BioEdit軟件中進行比對，結(jié)果如圖3所示，病原菌的5.8

S rDNA ITS區(qū)與原始茄病鐮孢菌5.8 S rDNA ITS區(qū)的同源性為100%。

3 小結(jié)與討論

致病菌對植物的損傷通常都會使植株表現(xiàn)出一定的病變特征，因此，植物病變特征是確定病原的依據(jù)之一。在本研究中鐵皮石斛組培苗發(fā)病植株表現(xiàn)為葉片枯黃或腐爛，部分莖枯黃、萎蔫甚至腐爛，病變明顯；對照組生長正常。由此可初步確定試驗組病變癥狀是由茄病鐮孢菌感染所致。成苗試驗組發(fā)病初期葉片似缺水萎蔫，后期萎蔫加重，葉片出現(xiàn)黃化之后枯萎，部分莖開始腐爛、倒伏，根開始腐爛萎縮。其癥狀與楊瑩瑩等[27]對鐮刀菌屬真菌引起的茄科植物枯萎病癥及董詩韜[11]對鐮刀菌屬真菌引起的鐵皮石斛枯萎病癥相似。但在本研究中鐵皮石斛成苗根部病變更為嚴重，且癥狀明顯。結(jié)合對照組情況可初步確定茄病鐮孢菌能夠感染鐵皮石斛成苗并使其發(fā)病。

為了進一步確定導致鐵皮石斛組培苗和成苗發(fā)病的致病菌為茄病鐮孢菌，本研究首先依據(jù)形態(tài)學鑒定方法，初步鑒定病原菌為茄病鐮孢菌。在此基礎(chǔ)上，運用分子生物學技術(shù)進行鑒定，其鑒定結(jié)果也顯示該菌的5.8 S rDNA ITS區(qū)與原始茄病鐮孢菌菌種的5.8 S rDNA ITS區(qū)序列同源性為100%，明確了從病變鐵皮石斛組培苗和成苗中分離得到的病原菌為茄病鐮孢菌，結(jié)合組培苗和成苗的發(fā)病狀況分析可知，茄病鐮孢菌感染能夠?qū)е妈F皮石斛發(fā)病，但組培苗和成苗的發(fā)病過程存在差異，試驗中鐵皮石斛組培苗接種茄病鐮孢菌菌懸液12～15 d植株全部死亡，病變植株表現(xiàn)為葉片枯黃、腐爛，部分莖枯黃、萎蔫甚至腐爛；成苗接種茄病鐮孢菌菌懸液60 d后植株死亡病變，植株表現(xiàn)為葉片枯黃，部分莖腐爛、倒伏，根腐爛萎縮。相比之下鐵皮石斛組培苗比成苗發(fā)病所需時間更短，病變癥狀更為明顯，危害更為嚴重。

在本研究的前期試驗中發(fā)現(xiàn)茄病鐮孢菌能夠捕食線蟲，捕食線蟲真菌都具有一定的生防作用，但是從本次研究的結(jié)果來看，茄病鐮孢菌對鐵皮石斛是有致病性的，在作為生防制劑使用時需慎重考慮。綜合相關(guān)文獻[28，29]，關(guān)于如何預防在鐵皮石斛栽培過程中由茄病鐮孢菌引起的病害提以下幾點建議：①茄病鐮孢菌生長最適pH為7.0～10.0，是一種喜偏堿性環(huán)境的病原真菌，因此適當提高土壤酸性，可施以偏酸性化肥如硫酸銨、氯化銨、過磷酸鈣、磷酸二氫鉀等；②茄病鐮孢菌在30 ℃的生長速度較25 ℃的快，因此適當控制大棚內(nèi)的溫度，以減緩其生長速度；③茄病鐮孢菌主要存在于土壤和作物的病殘體中，在種植鐵皮石斛時要及時處理作物的病殘體，以便控制傳染源。

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