雪蛤顆粒的安全性毒理學(xué)研究

彭曉輝 于向紅 樂智勇

[摘要] 目的 考察雪蛤顆粒的安全性。 方法 以SD大鼠和昆明種小鼠為受試動物，對雪蛤顆粒進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)）、大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)的研究。 結(jié)果 SD大鼠急性毒性試驗(yàn)經(jīng)口最大耐受量（MTD）大于15 g/kg，判斷雪蛤顆粒屬無毒類；Ames試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)：最高劑量為人體推薦攝入量的100倍，未引起大鼠整體健康狀況、生理生化功能和器官組織形態(tài)學(xué)等各項(xiàng)重要指標(biāo)的異常變化。 結(jié)論 雪蛤顆粒無明顯毒副作用，為其安全性評價提供了一定的依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 雪蛤；安全性；SD大鼠；小鼠

[中圖分類號] R994.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（a）-0032-04

Study on the safety and toxicity of Hashima Granules

PENG Xiaohui1 YU Xianghong1 LE Zhiyong2▲

1.Health Product Development， Kangmei（Beijing） Pharmaceutical Research Institute Company Limited， Beijing 102600， China； 2.Kangmei Pharmaceutical Company Limited， Guangdong Province， Guangzhou 515300， China

[Abstract] Objective To study the safety and toxicity of the Hashima Granules. Methods SD rat and Kunming mice were as test subjects， Acute oral toxicity test， genetic toxicity test （including Ames test， bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test）， 30 days feeding study in rats of Hashima Granules were carried on. Results MTD of acute oral toxicity test on SD rats was greater than 15 g/kg， and three genetic toxicity tests including Ames test， bone marrow micronucleus test， mice sperm abnormality test were all negative； 30 days rat feeding test showed that the highest dose was 100 times of recommended human intake， which did not cause abnormal changes in the key indicators of the overall health status， physiological and biochemical function and morphology and other organs and tissues of rats. Conclusion No obvious toxic and side effects of the Hashima granules are provided for the safety evaluation of the Hashima Granules.

[Key words] Hashima Granules； Safety； SD rat； Mice

雪蛤又稱林蛙油、哈蟆油，為蛙科動物中國林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙的輸卵管，經(jīng)干燥后形成的脂肪狀物質(zhì)，其性甘、咸、平，歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺的功效 。雪蛤是一種傳統(tǒng)的名貴中藥，富有滋補(bǔ)軟黃金的美譽(yù)，在我國清代被列為皇宮供品。雪蛤主要成分是蛋白質(zhì)，其次為糖類及脂肪，此外還含有人體所必需的多種微量元素[1-5]?，F(xiàn)代研究表明，雪蛤具有增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、延緩衰老等多種保健作用[6-10]。但目前國內(nèi)外對其毒性研究還很少，為研究雪蛤顆粒的安全性，本試驗(yàn)考察了雪蛤顆粒的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，為該產(chǎn)品的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)[11]。

1 一般材料

1.1 試驗(yàn)樣品

雪蛤顆粒，6 g/包，批號：20131101，由康美藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明種（KM）小鼠，雌雄各半，3月齡，25～30 g；30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)用SPF級SD大鼠，雌雄各半，21日齡，60～75 g，均來自四川省中醫(yī)藥科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK（川）2014-0009。急性毒性試驗(yàn)用SPF級SD大鼠，雌雄各半，3月齡，體重為180～220 g，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所養(yǎng)殖研究室提供。 動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行試驗(yàn)，飼養(yǎng)于屏障級動物房[許可證號：四川省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會SYXK（川）2013-011]。飼料由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，飲水為純凈水，整個實(shí)驗(yàn)期間動物自由飲水和攝食，動物房溫度維持在20～26℃，相對濕度40%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 急性毒性試驗(yàn)（MTD法）

SD大鼠20只，雌雄各半。設(shè)一個15 g/kg劑量組。準(zhǔn)確稱取雪蛤顆粒90 g，加蒸餾水至240 mL混勻，按2 mL/100 g于動物空腹?fàn)顟B(tài)下分2次經(jīng)口灌胃，間隔4 h，灌胃后觀察兩周內(nèi)動物死亡數(shù)及一般健康狀況，根據(jù)最大耐受量判斷雪蛤顆粒的急性毒性[12]。

2.1.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.1.2.1 Ames試驗(yàn) 采用符合要求的TA-97、TA-98、TA-100、TA-102菌株，進(jìn)行加與不加大鼠肝S9的標(biāo)準(zhǔn)平皿摻入法試驗(yàn)（S9mix用量為0.5 mL/皿）。雪蛤顆粒設(shè)5個劑量：8、40、200、1000、5000 μg/皿[準(zhǔn)確稱取雪蛤顆粒0.5 g于玻璃瓶中，加蒸餾水至10 mL，充分混勻后即為最高工作濃度50 mg/mL，其余濃度用蒸餾水1/5往下稀釋獲得，配制的最高工作濃度液100 μL加入平皿即為最高終濃度5000 μg/皿，其余濃度加樣量均為100 μL。所有配制好的雪蛤顆粒溶液采用8磅（1磅=7142 Pa）15 min高壓方式進(jìn)行滅菌]，同時設(shè)立自發(fā)對照組、溶劑對照組（滅菌蒸餾水100 μL/皿）和陽性對照組。不加S9試驗(yàn)的陽性對照組為0.2 μg/皿的TA97、TA98，1.5 μg/皿的疊氮化鈉（TA100），0.5 μg/皿的絲裂霉素C（TA102）；加S9試驗(yàn)的陽性對照組為0.2 μg/皿的TA97、TA98、TA100和50 μg/皿的TA102。每個試驗(yàn)劑量設(shè)3個平行皿，進(jìn)行一次重復(fù)試驗(yàn)[13-15]。

2.1.2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) KM小鼠（SPF級），隨機(jī)分為5組，雌雄各半，10只/組。設(shè)雪蛤顆粒（低2.5 g/kg、中5.0 g/kg、高10.0 g/kg）3個試驗(yàn)組，另設(shè)陰性對照組（蒸餾水）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）。動物分別于第0小時和第24小時按2 mL/100 g經(jīng)口灌胃，末次染毒后6 h處死，按規(guī)定制片。每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以含微核的嗜多染紅細(xì)胞千分率表示；每只動物計數(shù)200個嗜多染紅細(xì)胞中PCE和成熟紅細(xì)胞（NCE）所占數(shù)目，計算PCE/NCE比值[16]。

2.1.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) KM雄性小鼠，隨機(jī)分為5組，每組5只。分別為陰性對照組（蒸餾水）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg）和高10.0 g/kg、中5.0 g/kg、低2.5 g/kg 3個劑量組。按2 mL/100 g經(jīng)口灌胃小鼠，連續(xù)5 d。在首次灌胃后第35天處死動物，摘取雙側(cè)附睪，按要求制片，每只動物觀察1000個完整精子，記錄各類畸形精子數(shù)[17]。

2.1.3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

斷乳SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。設(shè)對照組（基礎(chǔ)飼料）和3、7、10 g/kg 3個雪蛤顆粒劑量組，分別相當(dāng)于人體推薦量的30、70、100倍。各劑量組飼料中雪蛤顆粒含量分別為30、70、100 g/kg（飼料），加工成顆粒飼料喂養(yǎng)動物，由于中、高劑量組雪蛤顆粒含量摻入飼料的量超過5%，故通過調(diào)整各組干酪素添加量使各組蛋白質(zhì)含量基本一致（每千克飼料中，低劑量組添加干酪素1.69 g，中劑量組添加干酪素4.22 g，高劑量組添加干酪素5.63 g）。動物自由攝食30 d。一周稱一次體重、兩次食物攝入量，計算攝食量，連續(xù)飼養(yǎng)30 d后處死動物，進(jìn)行血清生化學(xué)、血液學(xué)、臟器系數(shù)測定及組織病理學(xué)檢查[18-21]，分別按周攝食量及周增重計算食物利用率=周食用量/周體重增長質(zhì)量×100%。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法

采用PEM3.1《中國醫(yī)學(xué)百科全書·醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)》統(tǒng)計軟件包（第三版）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，各實(shí)驗(yàn)組和對照組均數(shù)比較使用方差分析，若方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，精子畸形率的比較采用秩和檢驗(yàn)，微核率的比較使用泊松分布法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 急性毒性試驗(yàn)

雪蛤顆粒15 g/kg劑量經(jīng)口染毒兩周內(nèi)未見動物死亡，亦無明顯中毒癥狀或不良反應(yīng)。即雪蛤顆粒對雌、雄SD大鼠的急性經(jīng)口MTD大于15 g/kg，按《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）判屬無毒類。見表1。

2.3.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.3.2.1 Ames試驗(yàn) 無論加與不加S9，自發(fā)對照組每皿平均回變菌落數(shù)都屬正常值范圍內(nèi)，陽性對照組誘發(fā)的每皿平均回變菌落數(shù)均達(dá)到自發(fā)對照組2倍以上，呈明顯陽性反應(yīng)。溶劑對照組和雪蛤顆粒各劑量組的平均回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)對照組的1倍，呈陰性反應(yīng)，說明雪蛤顆粒無誘導(dǎo)試驗(yàn)菌株回復(fù)突變的作用。見表2。

2.3.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 與陰性對照組比較，雪蛤顆粒各劑量組PCE/NCE比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表示雪蛤顆粒對小鼠骨髓細(xì)胞增殖無不良影響。泊松分布法結(jié)果顯示，陽性對照組雌、雄動物的微核率均顯著高于陰性對照組（P < 0.05），雪蛤顆粒各劑量組的微核率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表示雪蛤顆粒在小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)中為陰性結(jié)果。見表3。

2.3.2.3小鼠精子畸形試驗(yàn) 秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對照組的精子畸形率顯著高于陰性對照組（P < 0.05），雪蛤顆粒各劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示在小鼠精子畸形試驗(yàn)中雪蛤顆粒為陰性結(jié)果。見表4。

2.3.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

對照組和3個劑量組動物在30 d喂養(yǎng)期間，攝食、飲水、大小便均正常，生長發(fā)育情況良好，未觀察到明顯行為改變和中毒表現(xiàn)。

2.3.3.1 對體重和食物利用率的影響 雪蛤顆粒各劑量組的動物增重、攝食量、食物利用率基本正常。

2.3.3.2 對臟器系數(shù)的影響 雪蛤顆粒各劑量組的重要臟器重量和臟器系數(shù)（臟器濕重/空腹體重×100）基本正常。

2.3.3.3 末期血液學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)?zāi)┢诘某Ｒ?guī)血液學(xué)指標(biāo)（紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞及分類）測定結(jié)果。雪蛤顆粒各劑量組雌、雄鼠的測定指標(biāo)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表5。

2.3.3.4 末期生化指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果 低劑量組雄鼠的BUN和GLU顯著低于對照組（P < 0.05），中劑量組雌鼠的TP顯著低于對照組（P < 0.05），單變化在本實(shí)驗(yàn)室歷史對照范圍之內(nèi)，并無生物學(xué)意義。與陰性對照組比較，雪蛤顆粒其他各劑量組雌、雄鼠的腎功、肝功、血糖和血脂等生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表6。

2.3.3.5 組織學(xué)檢查結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束后對試驗(yàn)動物進(jìn)行了檢查，未發(fā)現(xiàn)明顯病變，所以僅選高劑量組和對照組動物的肝、腎、脾臟、空腸、睪丸和卵巢行組織學(xué)檢查。結(jié)果高劑量組各種病變例數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示少數(shù)動物所出現(xiàn)的病變與雪蛤顆粒無關(guān)，應(yīng)屬動物的自發(fā)病變。綜上所述，各劑量組動物臟器均未見由雪蛤顆粒引起的損害性改變。

3 討論

雪蛤顆粒對大鼠的急性經(jīng)口MTD大于15 g/kg，按《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，判為無毒類。3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)）均為陰性結(jié)果。在大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中動物生長發(fā)育良好，各劑量組血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)以及器官組織形態(tài)未見異常變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。據(jù)此初步推算雪蛤顆粒的最大無作用劑量大于10 g/kg（相當(dāng)于人體推薦量的100倍），在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)雪蛤顆粒無毒、無遺傳毒性，作為保健食品是安全的，可進(jìn)一步開發(fā)研究。

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（收稿日期：2015-11-15 本文編輯：趙魯楓）