高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜分析白楊素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

劉煒 姜金生 韋英杰

[摘要] 目的 探討白楊素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。 方法 給藥組以白楊素2 mg/mL的溶液灌胃雄性SD大鼠，同時空白組大鼠以等體積的溶劑灌胃。灌胃24 h后分別取兩組大鼠的尿液和糞便，同時分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h對兩組大鼠進行眼眶取血。應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用推測化合物的可能結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 在大鼠尿、糞便、血漿檢測到原型成分白楊素M1（白楊素），在大鼠糞、膽汁中檢測到M2（白楊素硫酸結(jié)合物）；此外，在大鼠尿液、血、膽汁等樣品中檢測到代謝成分M3-M4（白楊素葡萄糖醛酸結(jié)合物）。 結(jié)論 白楊素在大鼠體內(nèi)的主要代謝方式為Ⅱ相代謝，產(chǎn)物是葡萄糖醛酸結(jié)合物與硫酸結(jié)合物。

[關(guān)鍵詞] 白楊素；代謝；大鼠；LC-MS

[中圖分類號] R969.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（a）-0028-04

Metabolites analysis of chrysin in rat by high performance liquid chromatography–electrospray mass spectrometry

LIU Wei1，2 JIANG Jinsheng3 WEI Yingjie2，3

1.Jiangsu Province Hospital of TCM， the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.School of Pharmacy， Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210023， China； 3.Key Laboratory of Oral Drug Delivery System of Chinese Meteria， Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China

[Abstract] Objective To study the metabolism of chrysin in rats. Methods Drug group was given intragastric administration with chrysin solution 2 mg/mL， at the same time blank group was given intragastric administration with equal volume of solvent. Urine and feces of the two groups were taken after all rats were administered 24 hours later， at the same time at half an hour， 1 hour， 2 hours， 4 hours， 6 hours of the medicine given， all rats were performed orbital blood. Through LC-MS， according to the information， the possible structures of the compounds were speculated. Results In rat urine， feces and plasma， prototype components chrysin M1 was detected， M2 was detected in fecal bile （chrysin sulfate conjugates）； in addition， M3-M4 metabolites were detected in rat urine， blood and bile samples （chrysin glucuronide）. Conclusion The main metabolism method of chrysin in rats is phase Ⅱ metabolism， the metabolites are glucuronic acid conjugate and sulfuric acid conjugate.

[Key words] Chrysin；Metabolism；Rat；High performance liquid chromatography—electrospray mass spectrometry

白楊素（chrysin）（圖1），是一種具有廣泛藥理活性的黃酮類化合物。白楊素的化學(xué)名為5，7-二羥基黃酮[1]。白楊素具有抵抗癌癥、降低血壓、延緩衰老、擴張血管等藥理活性[2-3]。白楊素在體內(nèi)其5、7位羥基易被糖基化代謝導(dǎo)致活性降低[4-7]。對其結(jié)構(gòu)進行有效修飾，特別是在抗腫瘤方面結(jié)構(gòu)修飾的研究非常活躍[8]，對獲得高效低毒的新型候選藥物具有重要意義。

白楊素由Caco-2和鼠肝細胞代謝為葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物[9-10]，文獻[11]報道了人口服白楊素400 mg后血漿、尿液和糞樣中的代謝產(chǎn)物，結(jié)果在血漿中檢測到白楊素及白楊素硫酸結(jié)合物（chrysin sulphate），硫酸結(jié)合物的含量是原型成分的30倍，在尿液中檢測到白楊素及白楊素葡萄糖醛酸結(jié)合物（chrysin glucuronide），葡萄糖醛酸結(jié)合物的量是原型成分的10倍，同時通過對大鼠糞便樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)其中含有大量的白楊素；此外在大鼠膽汁中也發(fā)現(xiàn)了高濃度白楊素葡萄糖醛酸結(jié)合物的存在。說明白楊素在體內(nèi)生物利用度低，主要由糞便排出體外。大鼠口服白楊素與人空腸微粒體或大鼠腸微粒體共孵育后，產(chǎn)生兩種單葡萄糖醛酸結(jié)合物[12]。文獻[13]報道了大西洋鳉魚對白楊素的代謝，在魚膽汁中檢測到很少量原型白楊素，但卻檢測到兩種含量很高的葡萄糖醛酸結(jié)合物。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白楊素經(jīng)模式生物斑馬魚代謝后產(chǎn)生兩種單葡萄糖醛酸結(jié)合物和一種硫酸結(jié)合物[14]。

為了系統(tǒng)了解白楊素的代謝規(guī)律，本實驗采用的方法是電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-ESI-MS）與高效液相色譜法[15-16]，用以檢測大鼠尿、糞便、血漿和膽汁中白楊素的代謝產(chǎn)物，進而推測出大鼠體內(nèi)白楊素的代謝途徑，為之后的科研奠定了基礎(chǔ)[17-19]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

對照品：白楊素（S36906）（純度>97%，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；肝素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），生理鹽水（南京小營藥業(yè)集團有限公司，批號：2010070203）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；超純水（Milli-Q）。其余試劑為分析純。

1.2 動物

SD大鼠6只，雄性，年齡6個月，清潔級，健康狀態(tài)良好，體重（250±50）g，來源：上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2007-0026。

1.3 儀器

天平型號：METTLER AB135-S型（1/10萬，梅特勒-托利多儀器有限公司），高速離心機型號：TGL-16G型（上海安亭科學(xué)儀器廠）；低速自動平衡離心儀型號：TDZ5B-WS（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；MS3旋渦混合器（德國IKA公司）；氮吹儀型號：Orga-nomation N-EVAP TM 112（美國Organomation公司）。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號：Waters Alliance 2695-ZQ 2000（美國Waters公司），色譜工作站：Masslynx 4.0。

1.4 供試藥制備

稱取白楊素適量，以0.8%CMC-Na為溶劑配制成含白楊素2 mg/mL的溶液，供大鼠灌胃用。

1.5 分析條件

1.5.1 液相分析條件 色譜柱：Agilent SB-C18 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫：25℃；流動相：0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水；采用梯度洗脫：0～5 min，90%B，5～7 min，90%～80%B，7～20 min，80%～75%B，20～35 min，75%～25%B，35～37 min，25%～10%B，37～40 min，10%B。流速：1 mL/min。

1.5.2 質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源的各項參數(shù)中錐孔電壓：35 V（ESI-）（ESI負離子模式）、30 V（ESI+）（ESI正離子模式）；離子源溫度：120℃；輔助氣溫度：310℃；毛細管電壓：2.50 kV；干燥氣流流速：320 L/h；離子極性設(shè)定為：負離子（negative）掃描模式；離子檢測方式：全掃描（SCAN）模式，離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化模式（ESI），掃描范圍：從100 m/z至800 m/z，提取離子流（TIC）：[M-H]-，[M+HCOO]-。

1.6 給藥方法和樣品采集

1.6.1 大鼠尿樣 取SD大鼠6只，雄性，體重（250±50）g，實驗分組為白楊素給藥組與空白對照組，隨機平均給予每組3只大鼠。需注意實驗前12 h禁食但不禁水。給藥組分別一次灌胃3只大鼠以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg白楊素溶液，同時空白組灌胃3只大鼠等體積0.8%CMC-Na水溶液。24 h后，同時分別收集6只大鼠的尿液。立刻將收集到的尿液保存在-70℃冰箱中以備用。

1.6.2 大鼠糞便 上述SD大鼠在收集24 h尿液的同時，分別收集這6只大鼠24 h內(nèi)的糞便。同樣，立刻冷凍保存在-70℃冰箱中以備用。

1.6.3 大鼠血漿 在收集上述6只大鼠尿樣和糞便同時，分別在給藥0.5、1、2、4、6 h，以眼眶采血方式采集大鼠血液樣品，置于裝有肝素的試管中，混勻抗凝。將血液樣品進行離心操作， 3000 r/min離心10 min后取上清液，將各時間點血漿分別合并，立即放入-70℃冰箱中冷凍保存以備用。

1.6.4 大鼠膽汁 上述6只大鼠在上述實驗后，經(jīng)過10 d以上的恢復(fù)期開展下一步實驗。禁食不禁水12 h，肌肉注射1 g/kg濃度的烏拉糖溶液麻醉，麻醉后進行腹部膽管插管手術(shù)。待大鼠清醒時，白楊素給藥組給以0.8%CMC-Na溶液配制的25 mg/kg的白楊素溶液，空白組則給以與給藥組等體積的0.8%CMC-Na水溶液，于給藥12 h后分別收集各鼠的膽汁，立刻放入-70℃冰箱中冷凍保存以備用。

1.7 樣品處理

1.7.1 大鼠尿樣、血漿、膽汁處理 分別取白楊素給藥組的3只大鼠在各個時間段收集的尿液、血漿、膽汁2 mL，加入3倍體積的乙腈后，置于渦旋振蕩儀上渦旋混勻3 min，隨后3000 r/min離心10 min后用移液槍取上清液，轉(zhuǎn)移到EP管中，隨后在40℃條件下用氮氣吹干，接著在殘渣中加入1 mL乙腈溶解，再13 000 r/min離心15 min后取上清液，精密量取20 μL用高效液相色譜的方法進行檢測分析?？瞻讓φ战M同法處理。

1.7.2 大鼠糞便 分別取白楊素給藥組的3只大鼠在各個時間段收集的糞便樣品進行混合，置于研缽中進行研碎，精密稱取2 g，加入10倍量的70%乙腈浸泡后超聲30 min，3000 r/min離心10 min后取上清液，轉(zhuǎn)移到EP管中，用氮氣吹干（條件為40℃），在得到的殘渣中加入2 mL乙腈，溶解后再13 000 r/min離心15 min后取上清液，精密量取20 μL后用高效液相色譜的方法進行檢測分析。空白對照組同法處理。。

2 結(jié)果

在“1.5”項下的分析條件下，對白楊素給藥組大鼠尿液、糞便、血漿和膽汁的成分進行LC-MS分析：采用負離子模式檢測白楊素及其代謝產(chǎn)物。與空白組對照，提取離子流，根據(jù)負離子模式分子離子峰[M-H]-、[M+HCOO]-推測出可能分子量，檢出代謝產(chǎn)物。

2.1白楊素在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析

檢測出白楊素在大鼠的4個代謝產(chǎn)物為M1～M4。大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便的總離子流圖（TIC）及代謝產(chǎn)物提取離子流圖（EIC）見圖2。

在大鼠尿、糞便、血漿檢測到原型成分白楊素M1，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-253.1，[M+HCOO]-299.3，分子量為254；在大鼠糞、膽汁中檢測M2，分子量均為334，準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-333.0，同時中性丟失80 Da而得到碎片峰[M-H]-253.1，因此推測該代謝物為白楊素（MW254）與硫酸的結(jié)合物；此外，在大鼠尿液、血、膽汁等樣品中檢測到代謝成分M3-M4，準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-429.3，同時中性丟失176 Da得到碎片峰[M-H]-253.1，分子量為430，據(jù)此，推測為白楊素（MW254）與葡萄糖醛酸的結(jié)合物及其異構(gòu)體。白楊素及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1，質(zhì)譜圖見圖3。

實驗結(jié)果表明，白楊素在大鼠體內(nèi)主要以Ⅱ相代謝為主，白楊素可以原型存在，5或7位羥基與葡萄糖醛酸、硫酸形成結(jié)合型代謝產(chǎn)物。

3 討論

本研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)精確系統(tǒng)地檢測了白楊素在大鼠血漿、膽汁、尿和糞便中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)白楊素在大鼠體內(nèi)主要以Ⅱ相代謝反應(yīng)為主；并且大部分是以葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸結(jié)合物的形式存在，葡糖醛酸結(jié)合反應(yīng)要顯著強于硫酸結(jié)合反應(yīng)。這符合文獻[2]、文獻[9-11]和文獻[20]的研究發(fā)現(xiàn)，同時也驗證了作者團隊前期斑馬魚對白楊素代謝的合理性[16]。本研究較為全面地反映了白楊素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。

白楊素及其衍生物具有廣泛的藥理活性，其在體外具有較強的抗腫瘤活性，然而，由于白楊素在腸道內(nèi)難以吸收或發(fā)生代謝，因此生物利用度較低。嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。盡管近年來白楊素已成為新型抗癌藥物的研究熱點，然而關(guān)于白楊素體內(nèi)過程的研究較少，白楊素衍生物的體內(nèi)過程研究亦然。研究中發(fā)現(xiàn)白楊素在魚膽汁中有 2 個葡醛酸結(jié)合型代謝產(chǎn)物和痕量的原型藥物，白楊素主要分布在肝臟，是其他組織的 10 倍左右； 5， 7-甲氧基白楊素在魚體內(nèi)的代謝很少，大部分以 5， 7-甲氧基白楊素為主，以及少量葡醛酸結(jié)合型代謝產(chǎn)物， 5， 7-甲氧基白楊素主要分布在肝臟和大腦組織中。白楊素其他衍生物的體內(nèi)代謝還未見報道。受限于大鼠與人類的機體差異性，在后續(xù)研究中應(yīng)著重研究白楊素在大鼠與人體內(nèi)吸收、分布、代謝與消除的速率及方式的異同。為白楊素藥理藥效學(xué)研究、毒理安全性評價及結(jié)構(gòu)修飾提供更充分的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2015-11-18 本文編輯：趙魯楓）