高效液相色譜法同時測定金銀花中的六種成分

梁恕坤

摘要：建立同時測定金銀花（Lonicera japonica Thunb.）中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素含量的高效液相色譜法。采用Aglient phenyl柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.5%醋酸（B）為流動相梯度洗脫，在波長365 nm檢測綠原酸、在波長327 nm檢測咖啡酸，在波長358 nm檢測蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷，在波長368 nm檢測槲皮素，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。結果表明，6種化合物分別在測定范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，回收率為96.85%～103.61%。該方法準確、快速、簡單地進行金銀花中6種成分的測定。

關鍵詞：金銀花（Lonicera japonica Thunb.）；綠原酸；咖啡酸；蘆??；金絲桃苷；木犀草苷；槲皮素；高效液相色譜

中圖分類號：O657.72 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2100-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.046

Abstract：To develop an HPLC method for the determination of chlorogenic acid，caffeic acid， rutin， hyperoside，luteoloside， quercetin in Lonicera japonica Thunb. The analysis was carried out on an Aglient phenyl column（4.6 mm×250 mm，5 μm） by a gradient elution using（A） acetonitrile-（B）water（0.5% HAc），the detection was set at UV 365 nm to detecte chlorogenic acid，UV 327 nm to detecte caffeic acid，UV 358 nm to detecte rutin，hyperoside，luteoloside，UV 368 nm to detecte quercetin. The column temperature was 40 ℃ and injection volume was 10 μL. The recovery of the method was in the range of 96.85%～103.61%，and the six compounds showed good linear relationship in a detected concentration range. The method was proved to be precision，repeatability， simple and accurate.It was successfully applied to the analysis of the 6 components in Lonicera japonica Thunb.

Key words： Lonicera japonica Thunb.； chlorogenic acid；caffeic acid； rutin； hyperoside； luteoloside； quercetin； HPLC

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）是忍冬科植物忍冬、紅腺忍冬、山銀花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，主產區(qū)為山東平邑等地。藥理研究表明，金銀花具有抗菌、抗病毒、護肝、解熱、止血、抗氧化、降血脂等多種功效[1，2]，主要含有綠原酸、咖啡酸、奎寧酸、阿魏酸等有機酸，還含有蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素等黃酮成分，有機酸和黃酮是金銀花抑菌抗病毒的主要活性成分[3，4]。2010年版中國藥典將綠原酸和木犀草苷作為金銀花藥材的質量控制指標，采用C18柱和苯基柱分別測定，不利于快速鑒定金銀花藥材的成分。金銀花的成分分析一般采用C18柱，而使用苯基柱且采用變換波長同時測定金銀花中的6種成分，尚未見文獻報道，該方法簡單、快速、準確地分析金銀花的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10Atvp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SP-UV2000型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；電子天平（日本AN公司）。

1.2 試藥

綠原酸、木犀草苷（中國藥品生物制品檢定所）；蘆丁、咖啡酸（北京希凱創(chuàng)新科技有限公司）；槲皮素（天津馬克生物技術有限公司）；金絲桃苷（TREECHEM，編號Th110020）；乙腈、乙醇為色譜純，水為石英亞沸蒸餾水。

1.3 藥材

本地金銀花采自平邑魏莊、鄭成九間棚；外地金銀花購于各大超市、藥店。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Aglient phenyl柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈為流動相乙腈A，0.5%醋酸為流動相B，洗脫程序為0～22 min，A由10%→20%；0～11 min檢測波長為365 nm，11～15 min檢測波長為327 nm；22～25 min，A由20%→25%；25～28 min，A由25%→25%；25～28 min，A由25%→30%；28～32 min，A由30%→30%；15～28 min檢測波長為358 nm，28～40 min檢測波長為368 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素，用70%的乙醇溶液溶解制成0.129、0.041、0.042、0.046、0.044、0.038 μg/mL的對照品混合溶液，2 ℃避光保存。

2.3 供試品溶液的制備

取金銀花粉末（過80目篩）約2.0 g，精密稱量50 mL 70%的乙醇溶液，在功率150 W、頻率40 Hz下超聲1 h，冷卻至室溫后稱量，不足部分加70%的乙醇溶液補足后，靜置待分層后取適量用22 μm濾頭過濾，置于樣品瓶中待測。

2.4 線性關系考察

取“2.2”條件下的混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL分別注入高效液相色譜儀測定，以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸處理，得到線性回歸方程：綠原酸y=4.52×105x+24 058，r=0.999 9；咖啡酸y=5.66×106x-92 297，r=0.999 7；蘆丁y=1.80×106x-27 990，r=0.999 3；金絲桃苷y=2.34×106x-40 139，r=0.999 7；木犀草苷y=2.10×106x+17 170，r=0.999 5；槲皮素y=2.49×106x-37 547，r=0.999 7；線性范圍分別是0.012 9～10.32 μg、0.002 1～0.84 μg、0.002 1～0.84 μg、0.002 3～0.92 μg、0.002 2～0.88 μg、0.001 9～0.722 8 μg。

2.5 精密度試驗

精密稱量同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算得綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.67%、1.46%、1.48%、1.37%、1.67%、2.29%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，精密稱量供試品溶液，間隔一定時間進樣，測定峰面積。結果表明，8 h內6種成分峰面積的RSD分別為2.83%、2.26%、2.71%、2.35%、1.68%、2.59%。

2.7 重復性試驗

取同一產地藥材5份，按供試品溶液制備方法，分別測定綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素峰面積。結果表明，峰面積RSD為依次2.67%、2.94%、2.32%、2.72%、2.15%、2.83%。

2.8 加標回收率試驗

精密稱定6份金銀花粉末1.0 g，分別精密加入適量綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素對照品，按“2.3”方法進行測定并計算回收率。結果表明，綠原酸的平均回收率為97.68%，RSD為2.48%（n=6）；咖啡酸的平均回收率為101.23%，RSD為2.83%（n=6）；蘆丁的平均回收率為99.71%，RSD為2.47%（n=6），金絲桃苷的平均回收率為96.85%，RSD為2.25%（n=6）；木犀草苷的平均回收率為100.52%，RSD為1.85%（n=6）；槲皮素的平均回收率為103.61%，RSD為2.79%（n=6）。

2.9 樣品測定

取不同產地的金銀花藥材，按“2.3”方法制備供試品溶液，依次測定計算藥材中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素的平均質量分數(shù)，結果見表1。

3 小結與討論

本試驗中的洗脫程序改進了2010版《中國藥典》的洗脫方法，使得木犀草苷和前峰得到徹底分離，更能準確測定木犀草苷的含量。從樣品測定的結果來看，產地不一樣，各成分的含量存在差異；同一產地品種不一樣，其含量也不一樣；同一產地同一品種，處理工藝不一樣，其成分含量也存在差別。采用變換波長的方法，能準確、快速測定金銀花中的6種成分，可做為評判金銀花質量好壞的依據(jù)。

參考文獻：

[1] 馬成俊，李桂生，任召言，等.金銀花藥材對照指紋圖譜的建立及質量評價[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（2）：238-241.

[2] 梁生旺，崔永霞，王淑美，等.金銀花的HPLC藥效指紋圖譜研究[J].中草藥，2006，37（10）：1489-1493.

[3] 孫國祥，楊宏濤，鄧湘昱，等.金銀花的毛細管電泳指紋圖譜研究[J].色譜，2007，25（1）：96-100.

[4] 國家藥典委員會.中國藥典[Z].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.