• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    RNA干涉轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對卷葉病毒抗性的研究

    2016-10-19 13:11龔磊王艦楊永智
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年8期

    龔磊 王艦 楊永智

    摘要:利用大田統(tǒng)計方法,結(jié)合分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株進行抗病性鑒定,分析轉(zhuǎn)化群體中外源基因的插入信息,并利用雙夾心抗體酶聯(lián)免疫法技術(shù)研究受侵染后馬鈴薯卷葉病毒基因在這些轉(zhuǎn)化體中的表達情況。結(jié)果表明,一些株系出現(xiàn)了性狀突變,通過分子生物手段檢測發(fā)現(xiàn)大部分株系都有一定的馬鈴薯卷葉病毒抗性,但是抗性水平差異很大。試驗驗證了RNA干涉技術(shù)策略的可行性。

    關(guān)鍵詞:馬鈴薯卷葉病毒; RNA干涉(RNAi); 酶聯(lián)免疫檢測

    中圖分類號:S432.4+1;S532 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)08-1994-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.020

    Abstract: The field statistical method combined with molecular biology and bioinformatics methods were used to identify potato disease resistance of 23 transgene mutant strains, analyzing the transformation groupss external gene whose inserted information. And the double-direct sandwich ELISA technique was used to study infested potato leaf roll virus gene expression in the transformation of the body. The results showed that some character mutation strain appeared, most of the strains measured by the molecular biological tools had some potato leaf roll virus resistance, but the resistance level difference was big.

    Key words: potato leaf roll virus(PLRV); RNA interference(RNAi); enzyme-linked immune detection

    馬鈴薯卷葉病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)屬黃化病毒組,由蚜蟲以持久方式傳播,是馬鈴薯上最重要的病毒病害之一[1]。馬鈴薯卷葉病毒可侵染馬鈴薯引起卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網(wǎng)狀壞死等癥狀,嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì),是一種世界范圍的馬鈴薯重要病害[2-5]。

    RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象,是細胞內(nèi)的一種防御機制,可特異地降解細胞內(nèi)與之具有同源性的核酸[6],起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)編碼基因表達的作用。由于RNAi具有抗病毒表現(xiàn)型為高抗或近似于免疫、抗病性更持久、生物安全性高等優(yōu)點,具有更加廣闊的應(yīng)用前景[7-10]。因此,探討利用RNA介導(dǎo)抗性來培育抗病毒轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的這一新策略的可行性和應(yīng)用價值具有重要的現(xiàn)實意義。

    本試驗利用大田統(tǒng)計方法結(jié)合分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段對青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實驗室轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株進行抗病性鑒定,整個試驗以驗證RNA干涉技術(shù)策略的可行性,為得到對馬鈴薯卷葉病毒具有穩(wěn)定抗性的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗材料為青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實驗室轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭咴?號和脫毒175以及感染馬鈴薯卷葉病毒的馬鈴薯植株P(guān)LRV-2、PLRV-4、PLRV-8(表1)。所轉(zhuǎn)入的基因為RNA干涉片段,根據(jù)馬鈴薯卷葉病毒基因開放閱讀框設(shè)計引物擴增出2個片段,分別命名為PLRV1和PLRV2,大小分別為240 bp和400 bp。通過正向方向插入載體PCADS1341中,再通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株,通過驗證獲得轉(zhuǎn)基因材料。

    1.2 主要試劑及儀器

    主要試劑有十六烷基-三甲基-溴化胺(CTAB)(上海博奧生物科技公司)、PCR試劑(10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/μL Taq聚合酶)(Takara)、瓊脂糖(Agarose)(Biowest)、Marker2000(Takara)、ELISA試劑盒(Cygnus)。TE(pH 8.0):分別量取2 mL 1 mol/L的Tris HCL和0.4 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH 8.0)加入到150 mL去離子水中,攪拌混勻,加去離子水定容至200 mL,0.1 MPa、120 ℃高壓滅菌30 min,備用。

    主要儀器有DYY-2C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、Eppendorf Bio-photometer紫外分光光度計、S1000 Thermal cycle PCR儀(BIO-RAD)、PB303-N電子精密天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)、Eppendorf 5415D臺式離心機(德國)、Elx800酶標儀(Bio-tek),其他儀器及耗材均由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物所實驗室提供。

    1.3 大田抗病性試驗觀察

    1.3.1 大田試驗 將固體MS培養(yǎng)基中擴繁的小植株在株高4~5 cm時取出,假植于蛭石中,約2周后移入大田。2012年5月15日將轉(zhuǎn)基因材料及病毒株按隨機區(qū)組法種植于西寧市城北區(qū)農(nóng)林科學(xué)院生物所試驗田,共25株系,3個重復(fù),病毒株種植于小區(qū)間。行距×株距=70 cm×30 cm,小區(qū)間距1.5 m,小區(qū)寬3 m,長19 m,小區(qū)面積57 m2,區(qū)組面積171 m2,小區(qū)間面積57 m2,共計總面積228 m2。定植前對以上田塊進行深翻和施肥。

    1.3.2 蚜蟲傳染馬鈴薯卷葉病毒試驗 2012年6月當(dāng)轉(zhuǎn)基因株高15 cm時,用帶病毒的桃蚜(Myzus persicae Sulz)接種PLRV,每株10頭。傳毒前先將無毒蚜蟲放在感染PLRV的馬鈴薯上飼毒3 d,傳毒5 d后殺死蚜蟲,于接種5周后采集上部葉片檢測PLRV,用ELISA法和實時定量PCR測定。同時觀察葉片是否有典型的卷葉病特征。

    1.3.3 大田植株表型觀察 2012年7月13日在試驗田進行表型統(tǒng)計,對葉片的形狀、顏色、株高、花期進行觀察并分析是否有表型突變,同時觀察是否有典型的馬鈴薯卷葉病癥狀,記錄并分析。

    1.4 ELISA檢測

    在進行酶聯(lián)免疫之前用普通PCR對這些轉(zhuǎn)基因材料進行外源載體的潮霉素抗性基因檢測(HYG基因),證明外源基因沒有丟失。PCR所用上游引物為AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC,下游引物為TCTACACAGCCATCGGTCCAG。PCR擴增參數(shù):95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s;60 ℃退火40 s;72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    ELISA檢測步驟:①編號。將樣品對應(yīng)微孔按序編號,每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照3孔、空白對照3孔(空白對照孔不加樣品,加提取緩沖液,其余各步操作相同);②包被酶聯(lián)板。每孔加配制好的包被抗體100 μL,封板膜封板后置于37 ℃溫育4 min;③配液。將5倍Wash buffer加去離子水至1倍后備用;④洗滌。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)3次,拍干;⑤研磨。每樣品取0.1 g葉片于勻漿管中,加入1 mL提取緩沖液,勻漿機7 500 r/min;⑥加樣。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照100 μL。然后在待測樣品孔加待測樣品100 μL,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻;⑦溫育。用封板膜封板后置37 ℃溫育16 min;⑧洗滌。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)3次,拍干;⑨加酶標抗體。每孔加入酶標抗體100 μL;⑩溫育。37 ℃溫育1 h; 11 洗滌。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)4次,拍干;■配制底物液。將2 mL 5倍的底物緩沖液加去離子水至10 mL,再加2片PNPP底物藥片(裝底物液的瓶子用錫箔紙包裹);13 顯色。每孔先加入100 μL底物液,錫箔紙包裹酶聯(lián)板于37 ℃避光放置1 h;14 終止。每孔加終止液50 μL 2 mol/mL硫酸,終止反應(yīng);15 測定。在加終止液后15 min內(nèi),用Bio-tek的Elx800酶標儀測定OD值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大田植株表型變化

    5p2-4葉片小而多皺褶,4p2-9矮化(圖1),4p1-4、4p2-7植株高,5p2-6葉片皺縮,4p1-2矮化葉片小而稠密,4p1-1花期提前,4p2-6矮化,5p1-1較脫毒5號葉片顏色深,5p1-4葉片皺縮,稀疏,葉色淺(圖2),5p1-5葉片小而皺褶(圖3)。初步分析這些表型變化是由于在轉(zhuǎn)入外緣基因時改變或破壞了原有的一些形狀基因,如葉片形狀、顏色、株高,從而導(dǎo)致表型改變,真正原因還需要進一步的功能學(xué)研究。

    除了4號、5號外,轉(zhuǎn)基因各株系沒有出現(xiàn)典型的馬鈴薯卷葉病癥狀,如葉片卷曲、直立、干脆等。初步斷定所轉(zhuǎn)入的RNA干涉載體起到了沉默卷葉病毒基因的作用。

    2.2 ELISA檢測結(jié)果與分析

    從圖4可以看出,23個轉(zhuǎn)基因株系通過PCR均擴增出潮霉素抗性基因,表明轉(zhuǎn)基因材料在繼代培養(yǎng)過程中外源基因沒有丟失。圖5為對參試材料進行ELISA試驗的結(jié)果,顏色越深表明馬鈴薯卷葉病毒含量越高,植株的抗病性越差。反之表明植株中馬鈴薯卷葉病毒含量越低,抗性越強。

    2012年11月24日進行ELISA試驗,并用Bio-rad酶標儀進行測量。測量數(shù)據(jù)見表2、表3。

    利用Excel函數(shù)工具和SAS軟件對酶標儀測量數(shù)據(jù)進行分析得出,3個重復(fù)間相對標準偏差率小于15%,說明試驗操作重復(fù)性較好,數(shù)據(jù)可用于分析。

    其中4p1-3、4p2-3、4p2-7、4號、5p1-6、5p2-6、5號為陽性,初步說明除這幾個株系以外的株系均有一定的馬鈴薯卷葉病毒抗性,所轉(zhuǎn)入的RNA干涉載體起到了一定的干涉PLRV的作用。

    以高原4號為受體的轉(zhuǎn)基因株系與高原4號共15個株系,3個重復(fù)OD值及方差分析結(jié)果如表2所示。由表2可知,4p2-7與其他各號有極顯著差異(P<0.01),4p2-4與其他各號有極顯著差異,4p1-3、4號與其他各號有極其顯著性差異。

    以脫毒175為受體的轉(zhuǎn)基因株系與脫毒175共14個株系,3個重復(fù)的OD值及方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知,5號與其他各參試材料均有極顯著差異(P<0.01),5p1-6、5p2-6之間無顯著差異,但與其他各號有極顯著差異,5p1-6、5p2-6表現(xiàn)為陽性,可能是轉(zhuǎn)入的干涉載體作用較弱。

    3 小結(jié)與討論

    本試驗利用大田試驗發(fā)現(xiàn)了一些具有明顯特征突變的轉(zhuǎn)化體,初步推測轉(zhuǎn)入基因破壞了馬鈴薯生長素基因或者是生長素轉(zhuǎn)運蛋白基因,此現(xiàn)象可以作進一步的研究。

    通過PCR擴增出了900 bp大小的潮霉素抗性基因條帶,鑒定轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中外源存在;利用酶聯(lián)免疫法檢測技術(shù)研究受侵染后馬鈴薯卷葉病毒基因在這些轉(zhuǎn)化體中的表達情況,結(jié)果表明均有不同程度的抗性,從而驗證RNA干涉技術(shù)策略的可行性,為得到對馬鈴薯卷葉病毒具有穩(wěn)定抗性的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株提供依據(jù)。

    參考文獻:

    [1] 張鶴齡.馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)基因組研究進展[J].中國病毒學(xué),1996,11(1):1-8.

    [2] 李芝芳.中國馬鈴薯主要病毒圖鑒[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004.

    [3] 謝聯(lián)輝,林奇英,吳祖建.植物病毒名稱及其歸屬[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999.

    [4] DEVERS M,SOULAS G,MARTIN-LAURENT F. Real-time reverse transcription PCR analysis of expression of atrazine catabolism genes in two bacterial strains isolated from soil[J].Microbiol Meth,2004,56:3-15.

    [5] BAR-JOSEPH M,ROISTACHER C N,GARNSEY S M,et al. A review of tristeza, an ongoing threat tocitriculture[M]. In Proc Int Soc Citriculture,1981,l:419-423.

    [6] HAMMOND S M,CAUDY A A,HANNON G J. Post-transcriptional gene silen cing by double-stranded RNA[J]. Nat Rev Genet,2001,2(2):110-119.

    [7] BAULCOMBE D C. Viruses an d gene silencing in plants[J].Arch Virol Suppl,1999,15:189-201.

    [8] FIRE A,XU S Q,MONGOMERY M K,et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

    [9] SMITH N A,SINGH S P,WANG M B,et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407(6802):319-320.

    [10] 翟 浩.BYDVs編碼的兩種抑制子及其作用機制研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

    欧美另类亚洲清纯唯美| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲人与动物交配视频| 免费黄色在线免费观看| 晚上一个人看的免费电影| 国产在视频线在精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇高潮的动态图| 国产精品1区2区在线观看.| 永久免费av网站大全| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 九草在线视频观看| 黄色一级大片看看| 国产精品久久久久久久电影| ponron亚洲| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品人妻久久久影院| 欧美一区二区亚洲| 男人的好看免费观看在线视频| 能在线免费观看的黄片| 国产片特级美女逼逼视频| 99久久人妻综合| www.av在线官网国产| 欧美日韩在线观看h| 中国国产av一级| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av二区三区四区| 深夜a级毛片| 一级二级三级毛片免费看| 99热6这里只有精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 身体一侧抽搐| 男女国产视频网站| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩欧美在线乱码| 深夜a级毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本熟妇午夜| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av熟女| 如何舔出高潮| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| av视频在线观看入口| 久久草成人影院| 国产免费男女视频| 99久久精品热视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲国产精品国产精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费av毛片视频| 久久午夜福利片| 久热久热在线精品观看| 久久鲁丝午夜福利片| 免费观看a级毛片全部| 观看美女的网站| 欧美丝袜亚洲另类| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 最近手机中文字幕大全| 99久久精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品一区www在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品电影一区二区三区| 国产三级在线视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美高清性xxxxhd video| 国产黄片美女视频| 亚洲国产欧美在线一区| a级毛色黄片| 搞女人的毛片| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产最新在线播放| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 女人被狂操c到高潮| 欧美+日韩+精品| 五月伊人婷婷丁香| 一区二区三区免费毛片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人毛片60女人毛片免费| 精品久久国产蜜桃| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 简卡轻食公司| 特级一级黄色大片| 国产精品一及| 亚洲人与动物交配视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲美女视频黄频| 久久久久网色| 欧美+日韩+精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 好男人在线观看高清免费视频| 可以在线观看毛片的网站| 婷婷色麻豆天堂久久 | 精品不卡国产一区二区三区| 色哟哟·www| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产亚洲精品av在线| 中文欧美无线码| 青青草视频在线视频观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 精品久久久久久久久av| 能在线免费看毛片的网站| 成人二区视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品色激情综合| 免费观看的影片在线观看| 99热精品在线国产| 久久国产乱子免费精品| 一夜夜www| 性色avwww在线观看| 永久网站在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久99精品国语久久久| 一级毛片电影观看 | 秋霞在线观看毛片| 国产成人a区在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲在线观看片| av专区在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美bdsm另类| 69人妻影院| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 少妇高潮的动态图| 22中文网久久字幕| 日本午夜av视频| 变态另类丝袜制服| 69av精品久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产激情偷乱视频一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | av在线观看视频网站免费| 亚洲18禁久久av| 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 一级毛片我不卡| 成人欧美大片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 好男人在线观看高清免费视频| 中文资源天堂在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲成人久久爱视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 三级国产精品片| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲国产欧美在线一区| 男插女下体视频免费在线播放| 内地一区二区视频在线| h日本视频在线播放| 国产精品,欧美在线| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产精品国产精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品国产成人久久av| 国产人妻一区二区三区在| 欧美潮喷喷水| 午夜福利高清视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜精品国产一区二区电影 | 深夜a级毛片| or卡值多少钱| 国产单亲对白刺激| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本黄大片高清| 在线播放国产精品三级| 高清在线视频一区二区三区 | 国产色婷婷99| 国产精品乱码一区二三区的特点| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99热网站在线观看| av在线播放精品| 国产视频内射| 亚洲在久久综合| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲自偷自拍三级| 国产精华一区二区三区| 高清毛片免费看| 成年版毛片免费区| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国内精品宾馆在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 免费无遮挡裸体视频| av免费观看日本| 亚洲国产欧美人成| 午夜福利视频1000在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美97在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 最新中文字幕久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 国产成人午夜福利电影在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 精品久久久久久久久亚洲| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产最新在线播放| 日本一本二区三区精品| av.在线天堂| 七月丁香在线播放| 我要搜黄色片| 国产v大片淫在线免费观看| 高清视频免费观看一区二区 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人特级av手机在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久精品久久久久真实原创| 日本av手机在线免费观看| 超碰97精品在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产极品天堂在线| 九色成人免费人妻av| 午夜免费激情av| 99热这里只有是精品50| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产亚洲91精品色在线| 最近手机中文字幕大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 成年版毛片免费区| 精品一区二区免费观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 久久久成人免费电影| 久久人人爽人人片av| av.在线天堂| 欧美激情在线99| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产单亲对白刺激| 18+在线观看网站| 日韩精品青青久久久久久| 亚州av有码| 成人无遮挡网站| 九九爱精品视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产一区二区三区av在线| 男女边吃奶边做爰视频| 免费黄色在线免费观看| 久久久欧美国产精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 小说图片视频综合网站| 看非洲黑人一级黄片| 69av精品久久久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色网站视频免费| 变态另类丝袜制服| 免费看日本二区| 小说图片视频综合网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲图色成人| 色噜噜av男人的天堂激情| 热99re8久久精品国产| 全区人妻精品视频| 一区二区三区乱码不卡18| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 成人欧美大片| 国产黄a三级三级三级人| 国产在视频线在精品| eeuss影院久久| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 熟女电影av网| 成人无遮挡网站| 黄色一级大片看看| 欧美zozozo另类| 国产伦理片在线播放av一区| 舔av片在线| 秋霞伦理黄片| 国产精品三级大全| 丝袜喷水一区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 国产免费福利视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 卡戴珊不雅视频在线播放| av在线亚洲专区| 男女国产视频网站| 日韩欧美在线乱码| 嫩草影院精品99| 秋霞伦理黄片| 国产精品三级大全| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲自偷自拍三级| 日韩视频在线欧美| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人精品一,二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美成人精品欧美一级黄| 2022亚洲国产成人精品| 国产乱来视频区| 男人舔奶头视频| 亚洲国产色片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品欧美国产一区二区三| 国产熟女欧美一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 小说图片视频综合网站| 午夜免费激情av| 欧美区成人在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久免费精品人妻一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久久久久久午夜电影| kizo精华| 成人漫画全彩无遮挡| 免费av观看视频| 亚洲欧洲日产国产| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 色吧在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产成人免费观看mmmm| 男女那种视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产成人a区在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 99热这里只有是精品50| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 97超视频在线观看视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美不卡视频在线免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 成人二区视频| 三级国产精品欧美在线观看| 男女国产视频网站| 高清毛片免费看| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 热99re8久久精品国产| 中国美白少妇内射xxxbb| 99久久精品热视频| 1024手机看黄色片| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 我要搜黄色片| 成人欧美大片| 日韩强制内射视频| 国产又色又爽无遮挡免| 日本免费a在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日韩综合久久久久久| 一本久久精品| 日本黄大片高清| 麻豆成人午夜福利视频| 国产极品天堂在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产一区有黄有色的免费视频 | 麻豆国产97在线/欧美| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 人人妻人人看人人澡| 99九九线精品视频在线观看视频| www.av在线官网国产| 欧美成人a在线观看| av天堂中文字幕网| 国产精品熟女久久久久浪| 一区二区三区高清视频在线| 午夜激情福利司机影院| 日本与韩国留学比较| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 九色成人免费人妻av| 日本一本二区三区精品| 少妇丰满av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 寂寞人妻少妇视频99o| 丝袜美腿在线中文| 成人欧美大片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产69精品久久久久777片| 国产精品一区二区性色av| 69av精品久久久久久| 成人午夜精彩视频在线观看| eeuss影院久久| 最近的中文字幕免费完整| 白带黄色成豆腐渣| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利在线观看吧| 久久久欧美国产精品| 亚洲av福利一区| 在线播放国产精品三级| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人aa在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级毛片我不卡| 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 综合色丁香网| 精品不卡国产一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 成人三级黄色视频| 高清在线视频一区二区三区 | 成人亚洲精品av一区二区| 免费av毛片视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久精品94久久精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国内精品一区二区在线观看| 国产成人福利小说| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 永久网站在线| 午夜激情福利司机影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产单亲对白刺激| 七月丁香在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 69人妻影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人性生交大片免费视频hd| 美女大奶头视频| 天堂影院成人在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 性色avwww在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 秋霞在线观看毛片| 久久亚洲精品不卡| 联通29元200g的流量卡| 国产精品女同一区二区软件| av福利片在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美bdsm另类| 免费观看精品视频网站| 久久99热这里只频精品6学生 | 日本爱情动作片www.在线观看| 色网站视频免费| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 观看免费一级毛片| 日韩强制内射视频| 伦理电影大哥的女人| 老司机影院成人| 国产极品天堂在线| 国产久久久一区二区三区| 久久精品影院6| 麻豆成人av视频| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲欧美精品专区久久| 在线播放国产精品三级| 丰满乱子伦码专区| 黄色日韩在线| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲美女视频黄频| 午夜视频国产福利| 六月丁香七月| 亚洲精品自拍成人| 99久久人妻综合| 久久精品综合一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品一区二区三区视频在线| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久久久大av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品久久视频播放| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品人妻久久久影院| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 黑人高潮一二区| 国产淫语在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品欧美日韩精品| 波多野结衣巨乳人妻| 国产高清国产精品国产三级 | av.在线天堂| 久久午夜福利片| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲综合精品二区| 久久精品91蜜桃| 欧美色视频一区免费| 一区二区三区高清视频在线| 水蜜桃什么品种好| 神马国产精品三级电影在线观看| 青春草国产在线视频| 亚洲欧美精品专区久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜a级毛片| 高清在线视频一区二区三区 | 韩国高清视频一区二区三区| www.色视频.com| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久午夜福利片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品女同一区二区软件| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品456在线播放app| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产最新在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 日韩视频在线欧美| 久久韩国三级中文字幕| 午夜福利在线在线| 国产一区有黄有色的免费视频 | 99久国产av精品国产电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费人成在线观看视频色| 色播亚洲综合网| 国产乱人视频| 99久久成人亚洲精品观看| 一级二级三级毛片免费看| 欧美不卡视频在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天堂中文最新版在线下载 | 搞女人的毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国语自产精品视频在线第100页| 国产亚洲精品久久久com| 精华霜和精华液先用哪个| 99热精品在线国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产色爽女视频免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 久久热精品热| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久综合国产亚洲精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产 一区精品| 国产精品野战在线观看| 插阴视频在线观看视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产欧美日韩精品一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 免费看a级黄色片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 嫩草影院入口| 国产精品无大码| 国产激情偷乱视频一区二区| 一本久久精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一本一本综合久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲性久久影院| 能在线免费观看的黄片| 99久久中文字幕三级久久日本| 特级一级黄色大片| 久99久视频精品免费| 国产精品久久久久久精品电影| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲国产精品sss在线观看|