枯草芽孢桿菌21對玉米幼苗抗逆生理的影響

肖亞靜　于春生　張新　張雨竹　孫冬梅

摘要：探究枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對土傳病原菌脅迫下玉米抗逆生理的影響。采用土壤盆栽試驗，將禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和立枯絲核菌（Rhoctonia solani）接種到土壤中，用枯草芽孢桿菌21菌懸液處理，以多菌靈為對照。在玉米苗三葉一心期時，分別測定地上組織和地下組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量?？莶菅挎邨U菌21處理與多菌靈處理相比，玉米地上組織SOD和CAT酶活性差異不顯著，而POD酶活性提高了6.52%，地下組織抗逆酶活性顯著提高，其中SOD酶活性提高了99.70%，CAT酶活性提高了27.43%，POD酶活性提高了13.24%；玉米地下部分MDA含量無顯著差異，而地上部分MDA含量降低了7.91%。與多菌靈相比，枯草芽孢桿菌21主要通過提高玉米各組織中POD酶活性及地下組織中CAT酶活性，同時降低MDA含量，以提高其對土傳病原菌的抗性，從而對玉米幼苗起到保護作用，使其免受土傳病原菌的侵害。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）； 土傳病原菌； 抗氧化酶； 丙二醛； 多菌靈

中圖分類號：S482.2+92；Q939.92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-1998-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.021

Abstract： The effect of Bacillus subtilis strain 21 on maize resistance physiology under the stress of soil borne pathogens was studied. Using soil pot experiments， taking carbendazim as the control， bacterial liquid of B. subtilis strain 21 was inoculated into the soil， which had been inoculated with the two different pathogens， Fusarium graminearum and Rhoctonia solani. Three antioxidative enzymes and malonaldehyde contents in the aboveground and the underground organism of the maize at 3 leaf stage were determined. The results showed that the peroxidase activity was increased by 6.52% significantly in the aboveground organism in the soil treatment of B. subtilis strain 21， comparing with the treatment of carbendazim， and there was no significant change in the catalase activity and superoxide dismutase activity. The catalase activity， superoxide dismutase activity and peroxidase activity were significantly increased by 99.70%， 27.43%， 13.24%（P<0.05）， respectively， in the underground organism， comparing with the treatment of carbendazim. The malonaldehyde contents of the maize treated with B. subtilis strain 21 was reduced by 7.91% in aboveground organism comparing with the treatment of carbendazim， but there was no significant change in the malonaldehyde contents of the aboveground organism of the maize treated with. B.subtilis strain 21 has the ability of increasing peroxidase activity in all organisms of maize， catalase activity in underground organism of maize and decreasing MDA contents to protect the maize seedling from the injure of soil born pathogens， comparing with carbendazim.

Key words： Bacillus subtilis； soil borne pathogens； antioxidative enzyme； malonalde hyde； carbendazim

玉米莖腐病、紋枯病在中國各地均有發(fā)生，是一類具有毀滅性的土傳真菌病害。一般應用化學農(nóng)藥對其進行防治，但化學農(nóng)藥具有殘留期長，影響生態(tài)環(huán)境，易導致病原菌產(chǎn)生抗性等問題。目前利用生防菌劑控制玉米此類土傳病害的生物防治已成為研究熱點?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種微生物對玉米莖腐病、紋枯病土傳病菌具有拮抗作用，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有營養(yǎng)需求簡單、生長繁殖快、定殖能力強、易存活、抗逆性強、且具有促進植物生長及誘導植物抗性產(chǎn)生等特點[1，2]，因而被廣泛研究。玉米莖腐病主要由鐮刀屬（Fusarium）和腐霉屬（Pythium）引起，而中國東北三省則由多種鐮刀菌引起，以禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）和茄鐮刀菌（F. solani）出現(xiàn)頻率最高，一般年份發(fā)病率為10%～25%，嚴重年份可達50%[3]。玉米紋枯病主要由立枯絲核菌（Rhoctonia solani）引起，一般年份發(fā)病率為40%，嚴重時發(fā)病率達70%[4，5]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)主要的ROS酶清除系統(tǒng)，植物受到病原菌侵害時，這些ROS酶清除系統(tǒng)作為信號分子介導植物對外界刺激產(chǎn)生相應的生理生化反應，使植物免受氧化損傷[6]。Ju等[7]從蘋果中分離的一株枯草芽孢桿菌Y-1對鐮刀菌和立枯絲核菌的菌絲生長具有顯著的抑制作用，體內(nèi)試驗防治效果達92.26%，使蘋果體內(nèi)超氧化物歧化酶和過氧化物酶酶活性增強，產(chǎn)生誘導抗性。李德全等[8]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Bs-916及其突變菌株對水稻具有誘導抗性，使水稻體內(nèi)多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶和過氧化物酶3種酶的酶活性提高。有關生防菌對土傳病原菌脅迫下玉米體內(nèi)抗逆生理特性的研究相對較少，本課題組前期從土壤中分離并鑒定出一株枯草芽孢桿菌21，通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)其能顯著地抑制禾谷鐮刀菌和立枯絲核菌菌絲的生長。為了研究枯草芽孢桿菌21對土傳病原菌脅迫下玉米的生防機制，采用盆栽試驗，測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶3種抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量變化。以玉米為研究對象，在玉米三葉一心期，比較枯草芽孢桿菌21和多菌靈對土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地上組織和地下組織中3種抗氧化酶活性和丙二醛含量變化，為深入研究枯草芽孢桿菌生防機制和研發(fā)生防菌劑奠定基礎，同時對闡明玉米抗病性、拮抗菌生防機制及其生產(chǎn)應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌為黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院實驗室篩選的枯草芽孢桿菌21菌株，該菌株發(fā)酵用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[9]。病原菌為禾谷鐮刀菌和立枯絲核菌，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院實驗室保存，立枯絲核菌用PDA液體培養(yǎng)基[9]培養(yǎng)，禾谷鐮刀菌用PDA固體培養(yǎng)基[9]培養(yǎng)。

供試玉米為4單19。供試土壤為大慶市種植作物土壤。

1.2 方法

1.2.1 生防菌發(fā)酵 將保存于-20 ℃的枯草芽孢桿菌菌株21轉(zhuǎn)接到斜面試管活化，然后利用平板劃線法純化該菌株，單菌落擴增后接種到液體培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液，以8%的接種量接入到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，相同條件下振蕩培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液活菌數(shù)達到8.56×107 cfu/mL，備用。

1.2.2 病原菌準備 將保存于-20 ℃的禾谷鐮刀菌和立枯絲核菌利用PDA斜面試管活化，并制備鐮刀菌孢子懸液，使孢懸液濃度達到7.19×106 個/mL；活化好的立枯絲核菌28 ℃、120 r/min培養(yǎng)6 d，得到菌絲球，將菌絲球經(jīng)三層紗布過濾并用無菌水沖洗3次，榨汁機打碎，制備好的兩種病原菌等體積混合備用。

1.2.3 玉米種子處理 取健康、飽滿的供試玉米種子，用50～60 ℃無菌水處理10 min，沖洗3次，無菌水浸泡至其露白。

1.2.4 試驗設計 盆栽試驗設有3個處理：①病原菌；②病原菌+10 mL生防菌劑；③病原菌+25%多菌靈（0.094 g/盆）。每處理病原菌用量為30 mL/盆，每處理與風干土混勻后裝入塑料盆（直徑15 cm，高14.6 cm）中。每處理重復3次，每重復1盆，每盆播種15粒處于萌動狀態(tài)的玉米種子，留取大小一致的玉米苗，2片葉，每盆5棵。試驗期間，不同處理盆栽管理一致。播種后每隔2 d澆水1次，每盆每次澆水量相同。

1.2.5 枯草芽孢桿菌菌株21對土傳病原菌脅迫下玉米抗逆生理的影響 試驗于2014年4～7月在黑龍江八一農(nóng)墾大學土壤微生物資源利用實驗室進行。試驗采用盆栽法，取三葉一心期玉米苗，沖洗根部泥土，粗濾紙吸干表面水分，分離地上部分和地下部分，分別稱重，液氮速凍后放入-80 ℃保存。取1.0 g玉米組織置于預冷研缽中，加入10 mL 0.05 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿液4 ℃、4 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液，采用四氮唑藍光化還原法[10]測定超氧化物歧化酶活性，100 μL粗酶液和3 mL反應液在4 000 LX光照條件下反應30 min，黑暗終止反應，560 nm下測定OD值，以抑制NBT光化反應50%為一個酶活單位計算酶活性。采用愈創(chuàng)木酚法[11]測定POD酶活性，紫外吸收法[2]測定CAT酶活性，硫代巴比妥酸法[12]測定丙二醛含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件Duncan氏新復極差檢測法進行差異顯著性分析；Excel2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌菌株21對土傳病原菌脅迫下玉米幼苗抗逆生理的影響

2.1.1 對超氧化物歧化酶的影響 超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)重要抗逆酶之一，可由多種生物因子和非生物因子誘導產(chǎn)生，能夠清除體內(nèi)超氧陰離子，保護植物免受病原菌侵害或逆境條件下產(chǎn)生的氧化損傷，是植物抵抗病原菌侵染的主要防衛(wèi)反應之一[13]。由表1可知，不同處理對玉米幼苗地上組織中SOD酶活性的影響在數(shù)值上有一定的變化，但差異不顯著。不同處理對玉米幼苗地下組織SOD酶活性影響不同（表2），與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理SOD酶活性無顯著差異，病原菌+25%多菌靈處理SOD酶活性降低了52.20%，差異顯著。由此可知，枯草芽孢桿菌21菌株主要通過改變玉米幼苗地下部分SOD酶活性來提高其對土傳病原菌抗性，這可能與玉米幼苗根部與土傳病原菌及枯草芽孢桿菌21互作有關。與多菌靈相比，枯草芽孢桿菌21菌株發(fā)酵液降低了土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地下組織中SOD酶活性，從而更好地保護玉米幼苗免受土傳病原菌的侵害。

2.1.2 對過氧化氫酶的影響 過氧化氫酶是植物體內(nèi)清除H2O2的主要抗逆酶之一，可以徹底清除O2-對植物的氧化損傷，保護植物免受病原菌的侵害[14]。從表1和表2可以看出，不同處理對玉米幼苗地上組織和地下組織CAT酶活性產(chǎn)生不同程度的影響。就玉米幼苗地上組織而言，與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理CAT酶活性降低但差異不顯著，病原菌+25%多菌靈處理CAT酶活性降低了28.49%，且差異顯著，而病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理與病原菌+25%多菌靈處理間無顯著差異。玉米幼苗地下組織中，與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理CAT酶活性顯著提高了31.17%，而病原菌+25%多菌靈處理無顯著差異；與病原菌+25%多菌靈處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理CAT酶活性顯著提高了27.43%。說明枯草芽孢桿菌21菌株發(fā)酵液主要通過調(diào)控玉米幼苗地下組織CAT酶活性，來降低土傳病原菌對其侵害程度，且枯草芽孢桿菌21菌株發(fā)酵液可以顯著提高土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地下組織CAT酶活性，從而保護玉米幼苗免受土傳病原菌的侵害，且效果優(yōu)于多菌靈。

2.1.3 對過氧化物酶的影響 過氧化物酶是植物體內(nèi)抗逆酶之一，催化過氧化氫和有機過氧化物對各種有機物和無機物的氧化作用[15]。由表1可知，不同處理間玉米幼苗地上組織POD酶活性差異顯著。與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理POD酶活性提高了9.90%，病原菌+25%多菌靈處理提高了3.17%，與病原菌+25%多菌靈處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理POD酶活性提高了6.52%，且差異顯著。

不同處理對玉米幼苗地下組織POD酶活性影響不同（表2）。與病原菌處理組相比，病原菌+25%多菌靈處理無顯著差異，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理顯著提高了8.15%。說明枯草芽孢桿菌21菌株使土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地上組織和地下組織POD酶活性同時提高，且與多菌靈相比，枯草芽孢桿菌21能顯著提高土傳病原菌脅迫下玉米幼苗POD酶活性，從而保護玉米幼苗免受土傳病原菌的侵害。

2.1.4 對丙二醛的影響 丙二醛（MDA）是植物組織器官在衰老或逆境條件下，脂質(zhì)過氧化最終分解產(chǎn)物，反映了細胞膜受活性氧和自由基損害程度的大小[16]。不同處理對土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地上部分MDA含量的影響不同（圖1A）。與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理和病原菌+25%多菌靈處理MDA含量分別降低了26.32%和19.99%，與病原菌+25%多菌靈處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理MDA含量顯著降低了7.91%。

由圖1B可知，與病原菌處理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理和病原菌+25%多菌靈處理的玉米幼苗地下組織MDA含量分別降低了32.47%和32.78%，且差異顯著，而病原菌+10 mL枯草芽孢桿菌21處理和病原菌+25%多菌靈處理無顯著差異。說明枯草芽孢桿菌21可以降低土傳根腐病原菌脅迫下玉米幼苗膜脂過氧化程度，降低MDA含量，從而對玉米幼苗的生長起到保護作用。地上組織的研究結果表明，枯草芽孢桿菌21效果優(yōu)于多菌靈。地下組織的研究結果表明，枯草芽孢桿菌21和多菌靈的效果相當，因此，該生防菌有較高的利用價值。

3 小結與討論

植物抗逆酶的誘導產(chǎn)生與植物抗性機制密切相關[17]。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶是植物體內(nèi)抗氧化酶促防御系統(tǒng)中3個主要酶類，當植物受病原菌脅迫時，體內(nèi)自由基大量增生，使酶活性發(fā)生改變，3種酶協(xié)同作用可以降低植物體內(nèi)活性氧水平，減輕自由基對植物體造成的傷害，提高植物機體抗逆能力[18]。

3.1 土傳病原菌脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性

韋巧婕等[19]研究表明，黃瓜枯萎病拮抗菌芽孢桿菌屬菌株B能顯著提高黃瓜體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性，提高黃瓜抗病能力。本研究表明，施用枯草芽孢桿菌21并未提高土傳病原菌脅迫下的玉米幼苗地上組織中SOD和CAT酶活性，而使POD酶活性提高，枯草芽孢桿菌21對土傳病原菌脅迫下玉米幼苗地下組織SOD酶活性無顯著影響，但可以誘導其產(chǎn)生POD和CAT，由此可知枯草芽孢桿菌21主要通過提高玉米各組織中POD酶活性及地下組織中CAT酶活性，以提高其對土傳病原菌的抗性，從而對玉米幼苗起到保護作用。

3.2 土傳病原菌脅迫下玉米幼苗丙二醛含量變化

曾嶸等[20]研究發(fā)現(xiàn)黑脛病生防菌能顯著提高不同抗性煙草品種葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶酶活性，并顯著降低MDA含量的增長速度。本研究表明枯草芽孢桿菌21可以降低土傳根腐病原菌脅迫下玉米幼苗膜脂過氧化程度，降低MDA含量，從而對玉米幼苗的生長起到保護作用，且效果優(yōu)于多菌靈。

通過盆栽試驗可知，與多菌靈相比，枯草芽孢桿菌21可以誘導土傳病原菌脅迫下玉米幼苗產(chǎn)生抗氧化酶，從而對其產(chǎn)生保護性。與多菌靈相比，施用生防菌枯草芽孢桿菌21菌株，能更有效地降低土傳病原菌對玉米組織的損傷程度，其作用機制可能是通過提高玉米地下組織抗逆酶活性，進而提高玉米的防病能力，因而該菌株具有進一步研究和應用的價值，但其對土傳病原菌的田間防治效果如何還有待于進一步研究。

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