黃芪多糖對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究*

沈玉玨劉津軍 陳丁莉 田洪森 苗　毅 陳慧敏 霍燕飛 樊　蔚 溫芳華 葛亞肖

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北　邯鄲056001）

·研究報(bào)告·

黃芪多糖對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究*

沈玉玨△劉津軍 陳丁莉 田洪森 苗毅 陳慧敏 霍燕飛 樊蔚 溫芳華 葛亞肖

（河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲056001）

目的觀察黃芪多糖（APS）對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法無菌條件下分離并培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞72 h后分為空白對(duì)照組、H2O2組、APS（20、40和80μmol/L）+H2O2組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。給藥干預(yù)24 h后，觀察比較各組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和丙二醛（MDA）含量、培養(yǎng)液中心肌酶（AST、CPK、LDH）活性、細(xì)胞凋亡狀況及細(xì)胞凋亡率情況。結(jié)果倒置光學(xué)顯微鏡下，空白對(duì)照組呈單層簇狀生長(zhǎng)，且偽足多而飽滿，搏動(dòng)明顯，節(jié)律一致；H2O2組細(xì)胞胞漿空泡、偽足少，細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死，搏動(dòng)弱且頻率低、節(jié)律不齊等；APS各治療組與H2O2組比較，心肌細(xì)胞形態(tài)不同程度好轉(zhuǎn)，且以APS（80μmol/L）+H2O2組改善效果最明顯。H2O2組心肌細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較降低（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2組細(xì)胞存活率與H2O2組比較升高（P＜0.01）。H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、CAT活性與空白對(duì)照組比較降低，MDA含量則升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2組SOD、GSH-Px、CAT活性與H2O2組比較均升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量則降低（P＜0.01）。H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性與空白對(duì)照組比較均升高（均P＜0.01）。APS（40、80μmol/L）+H2O2組AST、CPK、LDH活性與H2O2組比較均降低（均P＜0.05或P＜0.01）。Flow Cytometry檢測(cè)空白對(duì)照組僅存在少量凋亡細(xì)胞，H2O2組凋亡細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組增多；與H2O2干預(yù)組比較，APS干預(yù)24 h可明顯改善H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況，其以APS（80μmol/L）+H2O2組效果最明顯。H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組比較升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2組細(xì)胞凋亡率與H2O2組比較則降低（P＜0.01）。結(jié)論APS可通過有效改善細(xì)胞生存狀態(tài)、提高細(xì)胞存活率、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)H2O2乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

黃芪多糖H2O2心肌細(xì)胞保護(hù)

【Abstract】Objective：To investigate the protective effects of Astraglus Polysaccharides on neonatal rat cadiocytes impared by H2O2.Methods：Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，APS（20，40，80μmol/L）+H2O2groups（n=10）.Twelve hours after the drugs were given，the morphology changes was observed；the survival rate was detected by MTT；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in cardiomyocytes were determinted；the activity of AST，CPK，LDH in culturemedium were detected；the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated.Results：Compared with H2O2group，themorphology of neonatal rat cadiocytes in APSgroups were significantly improved；the survival rate in APS（40，80μmol/L）+H2O2groupswere significantly increased；the activity of SOD，GSH-Px，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased；the activity of AST，CPK，LDH in culture medium were significantly decreased；the cardiomyocytes apoptosiswere improved and the apoptosis rate were significantly decreased，all of the difference were significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：APS can effectively improve neonatal rat cadiocytesmorphology，improve the activity of antioxidase and depress oxidative stress，improve the survival rate and decrease the apoptosis rate，suggesting that APShad protective effects on neonatal rat cadiocytes impared by H2O2.

【Key words】Astraglus Polysaccharides；H2O2；Cardiomyocytes；Protection黃芪為我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘性微溫，可益氣補(bǔ)虛。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種作用［1-3］。本研究觀察采用APS干預(yù)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷獲得了較好保護(hù)效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑黃芪多糖由西安沃森生物科技有限公司提供（批號(hào)20131205）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，由美國(guó)Gibco公司提供；二甲基亞砜（DMSO）、甲基四唑藍(lán)（MTT）由美國(guó)Sigma公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）試劑盒，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，由碧云天生物技術(shù)有限公司提供。

1.2動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD 1～3 d乳鼠［4］，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（冀）2008-1-003，合格證號(hào)：150513004。

1.3主要儀器SW-4T-2F潔凈工作臺(tái)，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；NU-4850E型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Nu Aire公司生產(chǎn)；VCX750型超聲波細(xì)胞破碎儀，由美國(guó)SONICS公司生產(chǎn)；UV762型紫外-可見分光光度計(jì)，由上海楚定分析儀器有限公司生產(chǎn)；BS-300型全自動(dòng)生化分析儀，由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)；iMark型酶標(biāo)儀、FACSAria型流式細(xì)胞儀，由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.4乳鼠心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)與分組［4］無菌環(huán)境下乳鼠開胸剪取心室組織，剪碎、加0.1%胰酶于37℃6 min振蕩消化，去上清、沉淀，0.1%胰酶繼續(xù)于37℃6min振蕩消化，如此反復(fù)至組織碎塊完全消化，收集消化上清液，1500 r/min離心10 min，取沉淀，加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)基（10%胎牛血清DMEM，內(nèi)含105U/L的青霉素和鏈霉素），吹打均勻，壁立1.5 h。收集未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至6×108個(gè)/L，接種于35 mm培養(yǎng)皿中（37℃、5%CO2、濕度100%），培養(yǎng)72 h，將狀態(tài)良好的原代乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、H2O2（200μmol/L）組、APS（20、40、80μmol/L）+ H2O2（200μmol/L）組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，檢測(cè)各指標(biāo)。

1.5觀察指標(biāo)1）細(xì)胞形態(tài)：藥物干預(yù)24 h后棄培養(yǎng)液，經(jīng)PBS溶液沖洗2次后，去離子水洗滌至顯微鏡下細(xì)胞間隙清晰止，晾干、倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照保存。2）細(xì)胞存活率：參照王知斌等［5］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，藥物干預(yù)24 h后，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板（n=6），每孔加20μLMTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后棄上清，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩15min，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算其細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%。3）細(xì)胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量：藥物干預(yù)24h后棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL PBS溶液、冰浴中破碎處理30 s，低溫離心取上清，紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定各組SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。4）培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性：藥物干預(yù)24 h后，分別取各組培養(yǎng)液并按各自試劑盒方法操作，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組細(xì)胞AST、CPK、LDH活性。5）細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡率：藥物干預(yù)24 h后，0.25%胰酶進(jìn)行消化，離心棄上清，PBS液沖洗2次，嚴(yán)格按AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作處理，避光孵育10 min后行Flow Cytometry檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞凋亡狀況；計(jì)算凋亡率，左上象限（Q1）表示碎片或損傷細(xì)胞，左下象限（Q3）表示正常細(xì)胞，右上象限（Q2）表示凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞，右下象限（Q4）表示早期凋亡細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（表示，組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)比較見圖1。倒置光學(xué)顯微鏡結(jié)果示，空白對(duì)照組呈單層簇狀生長(zhǎng)，且偽足多而飽滿，搏動(dòng)明顯，節(jié)律一致；H2O2組細(xì)胞胞漿空泡、偽足少，細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死，搏動(dòng)弱且頻率低、節(jié)律不齊等；APS各治療組與H2O2組比較，心肌細(xì)胞形態(tài)不同程度好轉(zhuǎn)，且以APS（80μmol/L）+H2O2組改善效果最明顯。

圖1　各組乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)的比較

2.2各組乳鼠心肌細(xì)胞存活率比較見表1。MTT法檢測(cè)結(jié)果示，H2O2組心肌細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較降低（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2組細(xì)胞存活率與H2O2組比較升高（P＜0.01）。

表1　各組乳鼠心肌細(xì)胞存活率比較（

表1　各組乳鼠心肌細(xì)胞存活率比較（

與H2O2組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n空白對(duì)照組10 H2O2組10 APS（20μmol/L）+H2O2組10存活率（%）97.4±4.7 43.5±6.3△△49.0±7.2 APS（40μmol/L）+H2O2組10 67.1±9.3**APS（80μmol/L）+H2O2組10 83.5±11.7**

2.3各組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比較見表2。結(jié)果示，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、CAT活性與空白對(duì)照組比較降低，MDA含量則升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+H2O2組SOD、GSH-Px、CAT活性與H2O2組比較均升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量則降低（P＜0.01）。

表2　各組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比較（

表2　各組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比較（

組別n空白對(duì)照組10 H2O2組10 APS（20μmol/L）+H2O2組10 APS（40μmol/L）+H2O2組10 APS（80μmol/L）+H2O2組10 SOD（U/mg）CAT（U/mg）GSH-Px（U/mg）MDA（nmoL/mg）109.5±16.4 32.0±6.3 3.76±0.95 6.24±1.38 65.7±13.2△△18.7±4.5△△1.88±0.74△△11.27±2.04△△70.9±15.1 20.8±5.3 2.07±0.76 9.03±1.81 84.2±16.8*25.7±6.4**2.43±0.82*8.42±1.65**100.7±19.5**28.5±7.0**2.61±0.85*6.73±1.49**

2.3各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性比較見表3。結(jié)果示，H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性與空白對(duì)照組比較均升高（均P＜0.01）。APS（40、80μmol/L）+H2O2組AST、CPK、LDH活性與H2O2組比較均降低（均P＜0.05或P＜0.01）。2.4各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較見圖2，表4。結(jié)果示，F(xiàn)low Cytometry檢測(cè)空白對(duì)照組僅存在少量凋亡細(xì)胞，H2O2組凋亡細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組增多；與H2O2干預(yù)組比較，APS干預(yù)24 h可明顯改善H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況，其以APS（80μmol/L）+H2O2組效果最明顯。H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組比較升高（P＜0.01）；APS（40、80μmol/L）+ H2O2組細(xì)胞凋亡率與H2O2組比較則降低（P＜0.01）。

表3　各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性比較（

表3　各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性比較（

組別n空白對(duì)照組10 H2O2組10 APS（20μmol/L）+H2O2組10 APS（40μmol/L）+H2O2組10 APS（80μmol/L）+H2O2組10 AST（U/mL）CPK（U/mL）LDH（U/L）21.8±3.6 1.42±0.35 530.7±64.9 34.1±6.2△△2.67±0.58△△925.4±127.3△△30.5±5.8 2.43±0.60 871.6±115.3 26.4±5.1*1.91±0.45**773.5±96.1*23.7±4.3**1.64±0.42**645.9±82.4**

圖2　各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡比較

表4　各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（

表4　各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（

組別n空白對(duì)照組10 H2O2組10 APS（20μmol/L）+H2O2組10凋亡率（%）4.4±1.8 53.6±8.3△△47.5±7.7 APS（40μmol/L）+H2O2組10 34.9±6.1**APS（80μmol/L）+H2O2組10 16.3±4.2**

3　討　論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其所誘發(fā)的急性心肌梗死嚴(yán)重危害人類的生命健康，目前其治療主要通過溶栓、介入手術(shù)等措施及時(shí)恢復(fù)血供，可極大地緩解缺血癥狀并降低死亡率，但“再灌注損傷”并發(fā)癥的存在嚴(yán)重影響著患者愈后。近年來研究發(fā)現(xiàn)，再灌后伴隨氧的大量進(jìn)入、氧自由基大量生成并過剩而誘發(fā)廣泛的氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)細(xì)胞凋亡，是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［5-6］。

正常狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基（ROS）的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡。在ROS的還原清除過程中有多種抗氧化酶參與，其中SOD被稱為體內(nèi)防御ROS損傷的第一道屏障，其可提供氫原子配體而催化還原ROS生成H2O2，并在GSH-Px或CAT的進(jìn)一步催化下生成對(duì)人無害的H2O和O2［7-8］，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能夠直接反映機(jī)體抗氧化能力；MDA為脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物，其含量可間接反映心肌細(xì)胞損傷程度。正常狀態(tài)下，血清中心肌酶含量極低，但當(dāng)細(xì)胞膜受氧自由基攻擊受損后可導(dǎo)致細(xì)胞中心肌酶（AST、CPK、LDH）等迅速釋放入血而致血清中AST、CPK、LDH活性突然增高，因此血清AST、CPK、LDH的活性水平可敏感反映心肌細(xì)胞受損的程度。細(xì)胞凋亡是一種有多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過程，陳良金等研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷是細(xì)胞凋亡最重要的誘發(fā)因素之一［9-15］。

本研究結(jié)果示，與空白對(duì)照組比較，經(jīng)APS干預(yù)24 h可有效提高H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率，改善SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量和培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性，抑制細(xì)胞凋亡，表明APS可保護(hù)H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞，其機(jī)制可能與APS能有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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Protective effects of Astraglus Polysaccharides on Neonatal Rat Cadiocytes Impared by H2O2

SHEN Yujue，LIU Jinjun，CHEN Dingli，etal.Handan Central Hospital，Hebei Province，Hebei，Handan 056001，China

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1675-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.009

2016-03-30）

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃（20130359）

（電子郵箱：zhjkhg@163.com）