模擬手法壓力刺激對(duì)頸性眩暈血瘀證患者血清損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的影響*

傅品來(lái)范志勇張競(jìng)之李　黎彭志允田　寧蘇碧瑩吳　栓

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東　佛山528200；2.廣東省中醫(yī)院，廣東　廣州510120；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東　廣州510260）

·研究報(bào)告·

模擬手法壓力刺激對(duì)頸性眩暈血瘀證患者血清損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的影響*

傅品來(lái)1范志勇2△張競(jìng)之3李黎2彭志允1田寧1蘇碧瑩1吳栓1

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東佛山528200；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260）

目的觀察模擬手法壓力刺激對(duì)頸性眩暈血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響及機(jī)制。方法將培養(yǎng)的頸性眩暈血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC-C）分為血瘀證組（DMEM+10%患者血清+0mmHg）、低壓組（DMEM+10%患者血清+90mmHg）和高壓組（DMEM+10%患者血清+180mmHg），健康對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液細(xì)胞+10%健康人血清+0mmHg），于相應(yīng)壓力干預(yù)實(shí)驗(yàn)后，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，MTT法檢測(cè)其活性，硝酸還原酶法檢測(cè)一氧化氮（NO）濃度，放射免疫分析技術(shù)測(cè)定內(nèi)皮素（ET）。結(jié)果經(jīng)過低壓力刺激干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)有一定變化，細(xì)胞活性有所提高，增加NO釋放、抑制細(xì)胞ET釋放，而高壓力刺激則無(wú)顯著影響。結(jié)論頸性眩暈血瘀證患者血清可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳つ茉鰪?qiáng)細(xì)胞的活性和維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，壓力刺激調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管舒縮活性物質(zhì)ET、NO合成釋放，這可能是手法發(fā)揮活血化瘀功效的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制之一。

推拿手法壓力刺激頸性眩暈內(nèi)皮細(xì)胞

【Abstract】Objective：To study the effect and mechanism of stress stimulation ofmanipulation on endothelial cellswith serum induced injury in patientswith blood stasis syndrome of cervical vertigo.M ethods：The cultivated HUVEC-C of injury induced by the serum of the patient of blood stasis syndrome（BSS）were divided into blood stasis syndrome group（DMEM+10%serum of the patient+0 mmHg），low pressure group（DMEM+10% serum of the patient+90 mmHg），high pressure group（DMEM+10%serum of the patient+180 mmHg）and healthy control group（DMEM cell of nutrient solution+10%healthy human serum+0mmHg）.After corresponding stress intervenes in the experiment，the change of its configuration was put upside down under themicroscope and observed，and its activity was tested by MTT assay，nitric reductase assay to measure NO concentration and radioimmunoassay（RIA）tomeasure ET.Results：After intervention of low stress stimulation，the cell configuration had some changes.Cell activity increased.It could increase NO release and inhibit release of ET.However，there was no obvious effectunder the high stress stimulation.Conclusion：The serum of the patientof blood stasis syndrome（BSS）can injure the vascular endothelial cell.Appropriate stress stimulation can increase the cell activity and maintain the cell configuration.Stress stimulation can regulate the synthetic release of ET and NO of vascular active substances in vascular endothelial cell，which may be one ofmechanisms of cell biology through technique effects of activating blood circulation to dissipate blood stasis.

【Key words】Manipulationmaneuver；Stress stimulation；Cervical vertigo；Endothelial cell

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在頸性眩暈及和血瘀證發(fā)病中起到重要作用，中醫(yī)推拿通過調(diào)控血管內(nèi)皮功能治療頸性眩暈具有良好效果，推拿起效往往又通過手法操作時(shí)產(chǎn)生的活血化瘀效應(yīng)。從目前研究看，推拿治療頸性眩暈產(chǎn)生活血化瘀效應(yīng)的研究多著眼于頸部軟組織、骨關(guān)節(jié)等層面，如松解痙攣的頸部肌群、糾正錯(cuò)縫

關(guān)節(jié)，增加椎動(dòng)脈血流量等，這些研究畢竟屬于宏觀層面的研究，缺少細(xì)胞分子等微觀層面的探討，給臨床、教學(xué)、科研帶來(lái)了諸多不便，嚴(yán)重制約中醫(yī)推拿的發(fā)展。要想在細(xì)胞分子等微觀層面探討推拿活血化瘀效應(yīng)的細(xì)胞力學(xué)機(jī)制，那么構(gòu)建推拿對(duì)細(xì)胞的力學(xué)加載模型必不可少［1-2］。本課題利用頸性眩暈血瘀證患者血清損傷培養(yǎng)的正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立血管內(nèi)皮損傷模型，采用能屏蔽體內(nèi)各種干擾因素的體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)為研究手段，實(shí)施壓力刺激模擬一維推拿力學(xué)手法，形成具有病證結(jié)合特點(diǎn)的推拿對(duì)損傷細(xì)胞的力學(xué)加載模型，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及合成釋放血管舒縮活性物質(zhì)內(nèi)皮素（ET）和一氧化氮（NO）的變化，為手法機(jī)械力學(xué)刺激“活血化瘀”理論提供細(xì)胞生物力學(xué)方面的基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源及試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC-C）購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；南美胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ET放免試劑盒（北京東亞免疫技術(shù)研究所），其他試劑如碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2病例選擇收集2015年8月至2015年11月廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院康復(fù)科門診及住院確診，頸性眩暈血瘀證患者20例為患者組。頸性眩暈的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照全國(guó)第2屆頸椎病專題座談會(huì)制定的診斷分型標(biāo)準(zhǔn)［3］及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［4］制定。1）發(fā)病常與頸部體位改變有關(guān)；2）頭痛，發(fā)作性或慢性頭痛，頭痛位于枕部；3）后頸部觸診檢查，患者棘突多有病理性移位，相應(yīng)的關(guān)節(jié)囊部位腫脹、壓痛；4）仰頭或轉(zhuǎn)頭試驗(yàn)陽(yáng)性，作該試驗(yàn)可誘發(fā)眩暈，惡心，耳鳴，視力減退，或卒倒；5）可伴發(fā)神經(jīng)根癥狀；6）X線平片可見正位片雙側(cè)鉤椎關(guān)節(jié)變尖，側(cè)方增生，棘突移位偏向一側(cè)；側(cè)位片生理曲度消失、變直，椎間隙狹窄，項(xiàng)韌帶鈣化；斜位片可見椎間孔變小，鉤椎關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生；7）經(jīng)顱多普勒超聲（TCD），一側(cè)或雙側(cè)椎-基底動(dòng)脈血流速度降低，腦血流量相對(duì)減少（一部分為流速加快）。血瘀證診斷參照1986年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。選擇2015年8月至2015年9月廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院招募健康志愿者20例為對(duì)照組。

1.3血清收集患者組及對(duì)照組均空腹取血，置入無(wú)菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后離心（4℃，2000 r/min，15min），取上清液置無(wú)菌EP管，凍存于-20℃，備用［6-7］。酶標(biāo)儀680型為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡及攝影裝置為德國(guó)Leica公司等。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC-C），所有操作均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。解凍復(fù)蘇后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代。用于共聚焦顯微鏡觀察的細(xì)胞種于0.5×0.5 cm2的蓋玻片上，所有操作均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.5細(xì)胞損傷模型的建立及傳代培養(yǎng)靜態(tài)培養(yǎng)頸性眩暈血瘀證血管內(nèi)皮細(xì)胞：參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)［7-9］擬定。取頸性眩暈血瘀證患者血清（含體積分?jǐn)?shù)為10%的CV患者血清培養(yǎng)液），干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），造成頸性眩暈血瘀證引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡鏡下觀察和記錄細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞成鋪路石樣，單層生長(zhǎng)、多形性、多梭形鑲嵌排列，每2～3日更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁的80%以上時(shí)傳代。

1.6細(xì)胞加力前培養(yǎng)［10-11］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶+0.1%EDTA混合消化液消化細(xì)胞，約3～5 min；當(dāng)瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時(shí)，用含10%小牛血清的DMEM終止消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按2×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板；顯微鏡下見細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；棄含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，準(zhǔn)確更換含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液3mL，再培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，備用。

1.7分組將實(shí)驗(yàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞樣本隨機(jī)分組，1）健康組：9000μL DMEM+1000μL健康人血清+0 mmHg壓力刺激。2）血瘀組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+0mmHg壓力刺激。3）低壓力組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+90 mmHg壓力刺激。4）高壓力組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+180mmHg壓力刺激。比較力學(xué)刺激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)狀況的影響。

1.8細(xì)胞力學(xué)加載方法1）低壓力組及高壓力組：將壓力刺激組的血管內(nèi)皮細(xì)胞置于壓力裝置中，然后移入37℃含5%CO2孵箱中，通過進(jìn)氣閥向高壓鍋內(nèi)持續(xù)供應(yīng)氣體以調(diào)節(jié)壓力穩(wěn)定在預(yù)定的水平。維持壓力裝置內(nèi)的壓力分別達(dá)到90 mmHg和180 mmHg，每組每次加壓時(shí)間都為2 h，兩次加力間隔24 h，共加力2次，加力完成后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察并提取細(xì)胞上清液或固定蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞以備檢測(cè)。2）健康組及血瘀證組：將血管內(nèi)皮細(xì)胞置于37℃含5%CO2孵箱中，不施加壓力刺激，于壓力組實(shí)驗(yàn)開始同步培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，提取細(xì)胞培養(yǎng)液以備檢測(cè)。1.9指標(biāo)檢測(cè)1）細(xì)胞的形態(tài)觀察：HUVEC-C細(xì)胞經(jīng)過干預(yù)后于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。2）MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性：將用不同條件培養(yǎng)基干預(yù)的每組8個(gè)復(fù)孔內(nèi)皮細(xì)胞分別加入20μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h，傾去上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。3）對(duì)細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響：細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的測(cè)定采用硝酸還原酶法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量，按試劑盒操作步驟進(jìn)行；細(xì)胞培養(yǎng)液中ET的測(cè)定采用放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)。各組取上清液500μL，用高速冷凍離心機(jī)制成干粉，然后稀釋成100μL的待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按ET測(cè)定試劑盒所述的均相競(jìng)爭(zhēng)法和非平衡法處理樣品，利用放射免疫γ計(jì)數(shù)器測(cè)定樣品中ET含量［12］。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)；與對(duì)照組的比較用單因素方差分析和組間q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組細(xì)胞形態(tài)比較倒置相差顯微鏡下觀察如圖1。1）健康組：細(xì)胞呈扁平狀、長(zhǎng)梭形、多角形或橢圓形，鑲嵌狀緊密排列，細(xì)胞核居中稍微隆起，部分細(xì)胞輪廓亦不清。2）血瘀證組：細(xì)胞多呈多角形或橢圓形，部分甚至呈圓形，細(xì)胞間隙變寬，部分細(xì)胞輪廓不清，大多細(xì)胞胞漿中有暗色顆粒，細(xì)胞碎片較多。3）低壓力組：細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、多角形或橢圓形，鑲嵌狀緊密排列，部分細(xì)胞胞漿中有暗色顆粒，部分細(xì)胞輪廓亦不清。4）高壓力組：多數(shù)細(xì)胞收縮變形，部分呈橢圓形，細(xì)胞碎片較多，部分細(xì)胞輪廓不清，細(xì)胞間隙變寬，大多細(xì)胞胞漿中有暗色顆粒。

圖1　倒置相差顯微鏡下觀察（200倍）

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性見表1。血瘀證組與健康組比較，細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預(yù)后，低壓力組與血瘀證組相比，細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高壓力組和與血瘀證組相比，細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高低壓力組比較細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　各組患者血清對(duì)細(xì)胞活性及內(nèi)分泌功能影響比較（

表1　各組患者血清對(duì)細(xì)胞活性及內(nèi)分泌功能影響比較（

與血瘀證組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高壓力組比較，▲P＜0.01。

組別n OD值ET（pg/mL）NO（μmol/L）健康組8血瘀證組8低壓力組8 0.435±0.011△△0.226±0.013 0.332±0.036△△▲126.409±3.744△△71.276±8.693△△218.320±17.908 27.023±3.893 178.833±40.856△41.065±9.372△▲高壓力組8 0.252±0.039 204.380±32.822 27.466±3.733

2.3對(duì)細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響見表1。1）血瘀證組與健康組比較，ET含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預(yù)后，低壓力組與血瘀證組相比，ET含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高壓力組與血瘀證組相比ET含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高低壓力組比較ET含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2）血瘀證組與健康組比較，NO含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預(yù)后，低壓力組與血瘀證組相比，NO含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高壓力組和與血瘀證組相比NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高低壓力組比較NO含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討　論

血瘀證見于臨床多科疾病，血管內(nèi)皮損傷為其共同的病理基礎(chǔ)。因此臨床同樣要重視血管內(nèi)皮功能損傷在頸性眩暈發(fā)病中的作用。目前中藥的活血化瘀效應(yīng)已經(jīng)得到很好的研究共識(shí)，而推拿療法雖然療效確切，但許多機(jī)制尚未明確，而尤其是推拿活血化瘀效應(yīng)還缺少微觀上的探討，因此本次研究以推拿對(duì)頸性眩暈血瘀證患者血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型作為研究的突破口，然后運(yùn)用細(xì)胞生物力學(xué)技術(shù)模擬推拿力學(xué)刺激對(duì)損傷模型進(jìn)行干預(yù)，因此有可能從微觀角度闡明推拿治療頸性眩暈的活血化瘀效應(yīng)是由手法機(jī)械刺激改變血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用所致［13-15］。

本次研究從血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)分泌功能分析了壓力刺激對(duì)頸性眩暈血瘀證患者血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的機(jī)制。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)看：頸性眩暈血瘀證患者的血管內(nèi)皮損傷的程度明顯，和健康組、壓力刺激組有明顯區(qū)別；從細(xì)胞活性看：和健康組相比，頸性眩暈血瘀證患者血清可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，而經(jīng)過低壓力刺激后細(xì)胞的OD值明顯提高，但是和健康組相比還是有較大差異，同時(shí)表明適當(dāng)?shù)牧W(xué)干預(yù)能增強(qiáng)細(xì)胞的活性和維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；從細(xì)胞內(nèi)分泌功能看：采用了最常用的血管舒縮因子ET及NO進(jìn)行檢測(cè)，NO是最主要的血管舒張因子，而ET是迄今所知的最強(qiáng)力的血管收縮因子，ET和NO的平衡對(duì)維持正常的血管內(nèi)皮功能起到至關(guān)重要的作用，本次實(shí)驗(yàn)也表明低壓力刺激在一定程度增加NO釋放、而抑制細(xì)胞ET釋放，這些均表明一定的低壓力刺激對(duì)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用。

當(dāng)然推拿作為機(jī)械力刺激的一種，不僅僅表現(xiàn)為壓力刺激，手法在作用時(shí)往往還包括了牽張力、剪切力的多種形式，而且還存在不同力學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的組合，如力學(xué)刺激的力量、頻率、時(shí)間，不同的發(fā)力形式、不同手法力學(xué)參數(shù)的組合勢(shì)必對(duì)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型產(chǎn)生不同的影響結(jié)果，這些均值得我們作進(jìn)一步探討。

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Effect of Stress Stimulation of M anipulation on Endothelial Cells w ith Serum Induced Injury in Patients w ith Blood Stasis Syndrome of Cervical Vertigo

FU Pinlai，F(xiàn)AN Zhiyong，ZHANG Jingzhi，et al.Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Guangdong Provincial，Guangdong，F(xiàn)oshan 528200，China.

R255.3

A

1004-745X（2016）09-1656-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.004

2016-06-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373520）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313345）；廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研立項(xiàng)（20141038）；廣東省佛山市科技局醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目（201308177）

（電子郵箱：fzystrong@163.com）