酒精性肝病患者肝組織cyp2e-3基因水平變化

王轉國，付強，樂永紅，莊小芳，王宏峰

酒精性肝病患者肝組織cyp2e-3基因水平變化

王轉國，付強，樂永紅，莊小芳，王宏峰

目的探討細胞色素cyp2e-3基因在酒精性肝?。ˋLD）發(fā)病中的作用。方法選擇2013年2月至2015年2月我院收治的ALD患者126例，按照病程分為A組40例（患病時間在1年以內）、B組43例（患病時間在1～3年）和C組43例（患病時間在3年以上），選擇同期來我院健康體檢的健康人121例作為對照。常規(guī)行肝活檢，采用熒光定量PCR技術檢測肝組織cyp2e-3基因水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清cyp2e-3蛋白水平，采用Western blotting法和免疫組織化學染色法檢測肝組織cyp2e-3蛋白表達情況。結果ALD患者肝組織cyp2e-3基因水平（34.8±1.7）顯著高于對照組【（6.6±0.7，P＜0.05】；經過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，不同組ALD患者血清cyp2e-3水平顯著升高；經Western-blotting法檢測，發(fā)現(xiàn)與正常人比，不同組ALD患者肝組織cyp2e-3水平顯著升高；隨著患病時間的延長，肝組織cyp2e-3基因表達量逐漸升高，cyp2e-3蛋白主要集中在肝細胞膜處表達，主要特征為大小不均勻的棕黃色小顆粒。結論酒精性肝病患者肝組織和血清cyp2e-3水平顯著升高，因此推斷cyp2e-3基因的激活可能在一定程度上促進了酒精性肝病的發(fā)生。

酒精性肝病；cyp2e-3基因；基因表達

過量飲酒問題已經成為世界性的公共衛(wèi)生問題［1］。Boccia S et al［2］相關研究表明，長期過量飲酒導致體內乙醇等化學物質含量過高不僅會損傷生殖細胞，同時可在一定程度上損傷肝臟細胞，促使肝細胞發(fā)生脂肪變性［3］、壞死，這一現(xiàn)象的持續(xù)惡化將會最終導致肝纖維化［4］和肝硬化［5］。Kang JW et al［6］認為酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）成因較多，其發(fā)病不僅受到環(huán)境因素的影響，同時也受到遺傳因素的制約。由于飲食習慣的差異，ALD在西方國家較為常見，但是隨著我國國民經濟的發(fā)展和人們生活方式的改變，ALD發(fā)病率在我國也逐年升高，目前已經成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝?。?］。Song BJ［8］研究表明乙醇誘導肝細胞色素cyp2e-3基因屬于亞鐵血紅素類蛋白質超家族酶系，在人體可以參與對內、外部物質的代謝活動。cyp2e-3基因主要在肝臟微小體表達，并可啟動微粒體的乙醇氧化途徑。因此，對于乙醇的代謝至關重要［9，10］。我們對cyp2e-3基因與酒精性肝病發(fā)病之間相互關系進行了初步研究，以期揭示該基因的作用，為酒精性肝病的防治提供一定的理論和實驗依據。

1　資料與方法

1.1研究對象選擇我院2013年2月至2015年2月收治的ALD患者126例作為研究對象，男性86例，女性40例；平均年齡（45.7±5.4）歲。按照病程將其分為A組、B組和C組，其病程分別為1年以內40例、1～3年43例，3年以上43例。ALD診斷根據《酒精性肝病診斷標準》進行，排除患有其它肝臟疾病，例如乙型肝炎、肝硬化以及肝癌患者。選擇同期正常人121例，78例，女性43例；平均年齡（43.5±6.8）歲。兩組在性別和年齡方面均無明顯差異（P＞0.05）。

1.2肝組織cyp2e-3檢測常規(guī)行肝穿刺，將肝組織標本立即保存于液氮中，用于蛋白提取和RNA抽提。采用ABI Stepone Plus檢測cyp2e-3基因mRNA水平，相關引物由上海生物工程有限公司合成。從液氮中取出凍存的肝組織0.1g，在冰上溶化，加入RNA Plus 0.45 ml，在預冷的研缽中將組織研碎，移入1.5 ml EP管中。在研缽中，加入RNA Plus 0.45 ml，洗滌后轉入離心管；向離心管中加入氯仿200 μl，劇烈震蕩15 s，冰上靜置15 min；12000 r/m 4℃離心15 min；將上清轉移到無RNase的EP管中，加入等量異丙醇，顛倒混勻后冰上靜置10 min；12000 r/m 4℃離心10 min；棄上清，加入75%乙醇750 μl，輕輕混勻，12000 r/m 4℃離心10 min；棄上清，盡量去除殘留乙醇；加入適量去RNase水，測定提取RNA質量，剩余用于反轉錄。根據NCBI提供的cyp2e-3基因序列，設計引物如下：F：5'-CCAAGTTCAAAGCGCT-3'；R：5'-AAAAGACCAAAGGCCAGCC-3'。按照TAKARA說明書進行熒光定量PCR操作。

1.3血清cyp2e-3水平檢測采用ELISA法（瑞士Roche公司）［11］，抗cyp2e-3購于Acris公司（德國）。取cyp2e-3蛋白標準品（購自Roche公司），加Dilution Buffer，行1：50稀釋，繪制標準曲線。取血清，行1：200稀釋，每孔加入待檢血清100μl，加入檢測液50μl，室溫孵育2 h，加入TMB顯色底物，在495 nm處測定吸光度值。根據標準曲線，計算待測樣品cyp2e-3蛋白水平。

1.4肝組織cyp2e-3蛋白水平檢測采用Westernblotting法，取肝組織，按照Thermo公司蛋白提取試劑盒說明書進行蛋白提?。?2］。Western-blotting操作方法參照《分子克隆手冊》進行。采用鏈霉素親和過氧化物酶（S-P）法對正常人和ALD患者肝組織常規(guī)進行抗體孵育以及染色。免疫組織化學染色結果評判標準如下［13］：膜染色＜10%或者無染色判定為陰性；僅有細胞膜被染色或者＞10%細胞可以觀察到膜染色則為陽性（+）；＞30%細胞呈現(xiàn)出中等染色則判定為++；＞50%細胞表現(xiàn)出較強的完全膜染色則判定為+++。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據進行處理。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1正常人與ALD患者肝組織cyp2e-3 mRNA水平比較通過RT-PCR技術檢測不同樣本中cyp2e-3基因mRNA水平，選用GAPDH基因作為內參，結果如圖1所示，與對健康人比，ALD患者肝組織cyp2e-3基因水平（34.8±1.7）顯著高于對照組（6.6±0.7），兩者之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖1　正常人與ALD患者肝組織cyp2e-3基因mRNA水平比較

2.2正常人與ALD患者血清cyp2e-3c比較經過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，不同組ALD患者血清cyp2e-3水平顯著升高（圖2）。

圖2　正常人與ALD患者血清cyp2e-3蛋白水平比較

2.3正常人與ALD患者肝組織cyp2e-3c比較經Western-blotting法檢測，發(fā)現(xiàn)與正常人比，不同組ALD患者肝組織cyp2e-3水平顯著升高（圖3）。

圖3　正常人與ALD患者肝組織cyp2e-3蛋白表達量比較A：正常人；B：A組ALD；C：B組ALD；D：C組ALD

2.4肝組織cyp2e-3蛋白表達情況經免疫組化檢測，ALD患者肝組織cyp2e-3表達陽性染色主要集中在肝細胞膜，其主要的特征為大小不均勻的棕黃色小顆粒，而在正常人肝組織中未見其陽性染色，說明酒精性肝病患者肝組織cyp2e-3表達增高（圖4）。

圖4　正常人與ALD患者肝組織cyp2e-3蛋白表達情況深藍色為肝組織細胞cyp2e-3表達3+，淺藍色為cyp2e-3陽性1+，藍色越深說明肝組織cyp2e-3表達量越高

3　討論

酒精性肝病是由于長期大量飲酒所引起的肝臟疾病，初期主要表現(xiàn)為脂肪肝，隨著病情的發(fā)展出現(xiàn)酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，甚至導致肝功能衰竭而死亡。因此，對于酒精性肝病的診治和預防十分重要。目前，酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尚不清楚，但是相關研究表明酒精性脂肪肝是由多基因與環(huán)境因素共同作用導致的。Cantor［14］研究結果表明定位于人體第10號染色體上的cyp2e-3基因被證明與酒精性脂肪肝發(fā)病相關，進一步研究結果表明CYP2E-3蛋白分子量為56.9 KD，其在機體內參與諸多氧化還原反應過程，例如cyp2e-3基因可以作為人體內代謝醇類物質的主要酶系［15］。謝瑞蓮等［16］研究結果表明，cyp2e-3基因可以催化的底物多達75種，而在這當中大部分前體物質均表現(xiàn)出一定的致癌性或者潛在的毒物性質。因此，cyp2e-3基因對于機體內部有害物質的代謝至關重要。迪吉等［17］研究表明cyp2e-3系統(tǒng)約占乙醇代謝能力的15%左右，而且可以在一定條件下被激活，而乙醇在人體內代謝速率的快慢在一定程度上可以反映出一個人酒量的大小。因此，目前有些學者認為cyp2e-3基因代謝通路與酒量大小之間存在一定的相關性。相關文獻表明［18］大量飲酒、食用腌制、油炸、煙熏食品在一定程度上可以促進機體內部cyp2e-3基因表達量的升高，即cyp2e-3基因的表達因多種危險環(huán)境因素的誘導而增加。Reddy VD et al［19］相關研究結果表明，cyp2e-3基因在人體內代謝乙醇的過程中會產生大量的自由基，而過多的自由基能在一定程度上對肝臟部位的膜結構造成損傷，引起肝臟中相關細胞的氧化還原反應。因此，cyp2e-3基因在酒精性肝病的發(fā)病過程中起到了關鍵的作用。但是，目前對于cyp2e-3基因與酒精性肝病之間相互關系的研究鮮見報道。因此，探究cyp2e-3基因與酒精性肝病之間相互關系對于揭示酒精性肝病發(fā)病機制以及后期治療均具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究結果表明，酒精性肝病患者肝組織cyp2e-3基因水平和蛋白表達量均顯著高于健康人，并且通過對不同酒精性肝病病程患者肝組織cyp2e-3基因表達量的測定發(fā)現(xiàn)，隨著患者患病時間的延長，cyp2e-3基因表達量更高，說明cyp2e-3基因與酒精性肝病患病之間存在相關性，即cyp2e-3基因的過表達參與了酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展。

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（收稿：2016-01-02）

（本文編輯：陳從新）

Hepatic cyp2e-3 gene expression in patients with alcohol liver disease

Wang Zhuanguo，F(xiàn)u Qiang，Le Yonghong，etal.
DepartmentofLiverDiseases，ChineseMedicineHospital，Urumqi830000，XinjiangUygur Autonomous Region，China

To explore the relationship between cyp2e-3 gene expression and alcoholic liver disease. MethodsIn the present study，we recruited 126 patients with alcohol liver disease（ALD）in our hospital from February 2013 to February 2015，and the patients were divided into group A（n=40，with the disease history less than one year），group B（n=43，with the disease history one to three years），and group C（n=43，with the disease history greater than three years）.We selected 121 healthy subjects at the same period for control.The hepatic cyp2e-3 mRNA was detected by quantitative PCR，serum cyp2e-3 levels were assayed by ELISA，and hepatic cyp2e-3 expression were detected by Western-blottingor stained immunohistochemistry.ResultsThe hepatic cyp2e-3 mRNA levels in patients with ALD were（34.8±1.7），much higher than【（6.6±0.7，P<0.05】in healthy persons；serum cyp2e-3 levels in patients with ALD were higher than in control too；Western-blotting and SP detection found that cyp2e-3 expression in liver tissues in group A，group B，and group C were much stronger than in healthy persons as no cyp2e-3 expression were found in the latter hepatic tissues.ConclusionThe activated expression of cyp2e-3 gene in liver tissues in patients with ALD might play a role in the occurrence of liver disease，and it warrants further study.

Alcoholic liver disease；cyp2e-3 gene；Expression

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.013

830000烏魯木齊新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院肝病科

王轉國，男，32歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。E-mail：254528425@qq.com

王宏峰，E-mail1xjwlmqwhf@sina.cn