三氧化二砷對膠原誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用機(jī)制研究△

劉志萍　郭俊峰　陳潔　張大昕

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，哈爾濱150001

三氧化二砷對膠原誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用機(jī)制研究△

劉志萍#郭俊峰陳潔張大昕

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，哈爾濱150001

目的分析三氧化二砷是否影響膠原誘導(dǎo)的血小板聚集及其作用機(jī)制。方法使用膠原誘導(dǎo)血小板聚集。采用光比濁法檢測三氧化二砷對膠原誘導(dǎo)的抑制作用，使用流式細(xì)胞儀檢測血小板聚集過程中表面膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）變化，使用免疫分析試劑盒檢測血小板聚集過程中釋放血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）的濃度。結(jié)果膠原誘導(dǎo)的血小板聚集過程中，三氧化二砷明顯抑制血小板血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的釋放。三氧化二砷并未影響血小板聚集過程中血小板表面GPⅡb/Ⅲa變化。結(jié)論三氧化二砷通過阻斷血小板TXA2激活路徑抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。

血小板聚集；三氧化二砷；糖蛋白Ⅱb/Ⅲa；血栓素A2

血小板除止血作用外，其促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用逐漸被重視。至今已證實(shí)阿司匹林衍生物、水蛭素、肝素等抗凝劑，可通過抑制血小板聚集來抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［1-2］，但是這些藥物的出血傾向限制其長期應(yīng)用。因此，一種既可以抑制血小板活性，又無出血不良反應(yīng)的藥物亟待問世。采用三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血病可有效避免患者凝血紊亂，并且三氧化二砷抑制血小板聚集作用已經(jīng)引起關(guān)注［3］，但其抗血小板聚集作用的機(jī)制尚不明確，現(xiàn)體外試驗(yàn)觀察三氧化二砷對人血小板聚集的抑制作用及其作用機(jī)制，報道如下。

1　材料與方法

1.1主要材料與儀器

阿司匹林、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa單克隆抗體7E3購于美國Sigma公司。三氧化二砷購于哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司。標(biāo)記GPⅡb/Ⅲa熒光試劑（PAC1-FITC）購于美國BD公司。ELISA法TXB2檢測試劑盒購于英國Pharmacia公司。光學(xué)血小板聚集分析儀（ChronoLog-560CA）購于美國VASTEC公司。雙激光五色流式細(xì)胞儀（FC500）購于美國Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1制備清洗血小板健康志愿者采集靜脈血10 ml加入枸櫞酸鈉1∶9抗凝管中，于30 min內(nèi)離心10～15 min（1000 rpm/min），取上層富含血小板血漿，再次離心10 min（2500 r/min），使用CGS緩沖液（0.12 mol/L NaCl+12.9 mmol/L檸檬酸三鈉+ 30 mmol/L葡萄糖，pH 6.5）清洗沉淀血小板兩次，將血小板懸浮于新鮮的臺氏緩沖液，調(diào)整血小板濃度為300×106/ml，37℃靜置1 h備用。

1.2.2血小板聚集試驗(yàn)比濁杯中加入200 μl血小板（300×106/ml）及50 μl膠原蛋白（1 μmol/L），磁棒攪拌，光學(xué)血小板聚集分析儀監(jiān)測血小板聚集15 min，記錄血小板最大聚集率。

1.2.3GPⅡb/Ⅲa檢測當(dāng)血小板聚集達(dá)到50%最大透光度，使用10倍生理鹽水終止聚集反應(yīng)。將樣品與PAC1-FITC（10 μg/ml）室溫下避光孵育5 min，使用流式細(xì)胞儀分析記錄血小板表面GPⅡb/Ⅲa熒光強(qiáng)度。

1.2.4血栓素A2檢測血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）釋放后很快轉(zhuǎn)化成TXB2，檢測TXB2用以代表TXA2濃度。當(dāng)血小板聚集達(dá)到50%最大透光度，使用10倍生理鹽水終止聚集反應(yīng)。離心后留上清液供ELISA法檢測TXB2濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行研究分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度三氧化二砷抑制血小板聚集

將不同濃度三氧化二砷（0、1、5、10、20、30 μmol/L）50 μl與200 μl血小板（200×106/ml）37℃孵育3 min，加入50 μl膠原蛋白（1 μmol/L）。以上濃度血小板最大聚集率分別為：（45±3.5）%、（37±2.1）%、（31±2.3）%、（27±1.9）%、（26±1.5）%、（23±1.6）%。三氧化二砷0、1、5、10 μmol/L對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集抑制呈濃度依賴，4種濃度聚集率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；20 μmol/L和30 μmol/L三氧化二砷對血小板聚集抑制與10 μmol/L相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.542，P=0.068）。選擇三氧化二砷10 μmol/L作為下一步實(shí)驗(yàn)濃度。（圖1）

圖1　不同濃度三氧化二砷對膠原誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用

2.2不同抑制劑作用于膠原誘導(dǎo)的血小板聚集

膠原組：膠原蛋白（1 μmol/L）誘導(dǎo)血小板聚集；7E3組、阿司匹林組、三氧化二砷組：將抗體7E3（20 μg/ml）、阿司匹林（50 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）各50 μl分別與200 μl血小板（300×106/ ml）孵育3 min，加入50 μl膠原（1 μmol/L）誘導(dǎo)血小板聚集。各組最大聚集率分別為（圖2）：膠原組（45±3.5）%、7E3組（30±2.6）%、阿司匹林組（23± 2.4）%、三氧化二砷組（27±1.9）%。7E3與阿司匹林均為血小板抑制劑，為陽性對照。三氧化二砷組與膠原組最大聚集率比較，三氧化二砷明顯抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，P＜0.001。

圖2　不同抑制劑對膠原誘導(dǎo)血小板聚集的抑制

2.3血小板表面GPⅡb/Ⅲa變化

對照組：未經(jīng)膠原處理的血小板作為陰性對照。膠原組：膠原蛋白（1 μmol/L）誘導(dǎo)血小板聚集。7E3組、三氧化二砷組：將7E3（20 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）各50 μl分別與血小板（300× 106/ml）孵育3 min，加入膠原誘導(dǎo)血小板聚集。以上各組檢測GPⅡb/Ⅲa熒光強(qiáng)度，記錄各組與對照組比值。如圖3所示，膠原組、7E3組、三氧化二砷組熒光強(qiáng)度分別為（405±13）%、（273±11）%、（392± 11）%。7E3為血小板GPⅡb/Ⅲa抗體，此組為陽性對照。三氧化二砷組與膠原組比較，GPⅡb/Ⅲa熒光強(qiáng)度無差別（P=0.229）。

圖3　不同處理組對膠原誘導(dǎo)血小板表面GPⅡb/Ⅲa的影響

2.4血小板釋放TXA2

對照組：未經(jīng)膠原處理的血小板作為陰性對照。膠原組：膠原蛋白（1 μmol/L）誘導(dǎo)血小板聚集。阿司匹林組、三氧化二砷組：將阿司匹林（50 μg/ml）、三氧化二砷（10 μmol/L）分別與血小板（300×106/ml）孵育3 min，加入膠原誘導(dǎo)血小板聚集。以上各組檢測TXB2，記錄各組與對照組比值。如圖4所示，膠原組、阿司匹林組、三氧化二砷組TXB2濃度分別為（137±10）%、（89±9.6）%、（114±7.2）%。阿司匹林為血小板釋放TXA2抑制劑，此組為陽性對照。三氧化二砷組與膠原組比較，TXB2釋放明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019）。

3　討論

血小板在腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)血小板具有以下功能［4］：包被在腫瘤細(xì)胞外以保護(hù)腫瘤細(xì)胞；能夠輔助腫瘤細(xì)胞穿出血管到達(dá)轉(zhuǎn)移位置；分泌生長因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲；有助于腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，腫瘤患者血液中血小板數(shù)量增高，直接影響預(yù)后。非小細(xì)胞肺癌術(shù)前血小板數(shù)量＞300×106/ml［5］；結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血小板數(shù)＞380×106/ml［6］，為無病生存及總生存不良預(yù)后因素。

圖4　不同處理組對膠原誘導(dǎo)血小板釋放TXA2的影響

血小板具有完整的胞膜，被激活后表達(dá)各種膜受體。整合素為血小板表面受體的一個大家族，其中糖蛋白Ⅱb/Ⅲa介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的黏附，在腫瘤細(xì)胞與血小板膜相互作用中發(fā)揮重要作用。Zhang等［1］研究發(fā)現(xiàn)，血小板表面GPⅡb/Ⅲa參與惡性黑色素瘤細(xì)胞與血小板相互作用，肝素衍生物抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞與血小板表面GPⅡb/Ⅲa聯(lián)結(jié)，并且肝素衍生物抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞與血小板在肺血管內(nèi)相互黏附，抑制轉(zhuǎn)移灶形成。Lonsdorf等［7］使用肺轉(zhuǎn)移鼠模型發(fā)現(xiàn)，利用抗體阻滯血小板表面GPⅡb/Ⅲa，使惡性黑色素瘤細(xì)胞系B16肺轉(zhuǎn)移減少。

TXA2存在于血小板內(nèi)，激活后釋放于細(xì)胞外，作用于血小板表面血栓素前列腺素（thromboxane prostanoid，TP）受體，促進(jìn)血小板聚集。TXA2前體為花生四烯酸（arachidonic acid，AA），中間經(jīng)環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）作用生成TXA2，阿司匹林通過抑制COX減少TXA2生成。阿司匹林抑制TXA2生成具有劑量依賴性，口服100 mg阿司匹林能夠完全抑制TXA2生成［8］。因此，口服小劑量阿司匹林不僅能預(yù)防動脈粥樣硬化、預(yù)防靜脈血栓，還能夠預(yù)防結(jié)腸癌［9］。但長期服用阿司匹林有胃腸道出血傾向。

三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）已經(jīng)取得較好的療效，并且在治療APL過程中，能夠有力控制APL伴隨的凝血異常。Lin等［3］發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，其機(jī)制為抑制PLCg2-PKC-p38 MAPK級聯(lián)反應(yīng)，引起鈣離子與自由基形成減少。Hoffman等［10］經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，三氧化二砷抑制MCF-7與WM-115細(xì)胞系的促凝活性。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三氧化二砷抑制血小板聚集，明顯抑制血小板TXA2釋放，但未影響血小板表面受體GPⅡb/Ⅲa表達(dá)，可見三氧化二砷除抑制MAPK級聯(lián)反應(yīng)外，尚能夠通過抑制TXA2釋放來抑制血小板聚集。TXA2釋放被抑制的過程包括：TXA2由花生四烯酸衍變生成，TXA2分泌于血小板外。關(guān)于三氧化二砷作用于此過程的具體環(huán)節(jié)尚不確定，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

［1］Zhang CM，Liu Y，Gao YG，et al.Modified heparins inhibit integrin αIIbβ3 mediated adhesion of melanoma cells to platelets in vitro and in vivo［J］.Int J Cancer，2009，125（9）：2058-2065.

［2］Medina C，Harmon S，Inkielewicz I，et al.Differential inhibition of tumour cell-induced platelet aggregation by the nicotinate aspirin prodrug（ST0702）and aspirin［J］.Br J Pharmacol，2012，166（3）：938-949.

［3］Lin KH，Chang YF，F(xiàn)an CY，et al.Arsenic trioxide-mediated antiplatelet activity：pivotal role of the phospholipase Cγ2-protein kinase C-p38 MAPK cascade［J］.Thansl Res，2010，155（2）：97-108.

［4］Jain S，Harris J，Ware J.Platelets linking hemostasis and cancer［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（12）：2362-2367.

［5］Zhang H，Zhang L，Zhu K，et al.Prognostic significance of combination of preoperative platelet count and neutrophillymphocyte ratio（COP-NLR）in Patients with non-small cell lung cancer：based on a large cohort study［J］.Plos One， 2015，10（5）：e0126496.

［6］Jósa V，Krzystanek M，Vass T，et al.Thrombocytosis of liver metastasis from colorectal cancer as predictive factor［J］. Pathol Oncol Res，2015，21（4）：991-997.

［7］Lonsdorf AS，Kr?mer BF，F(xiàn)ahrleitner M，et al.Engagement of αIIbβ3（GPIIb/IIIa）with ανβ3 Integrin mediates interaction of melanoma cells with platelets：a connection to hematogenous metastasis［J］.J Boil Chem，2012，287（3）：2168-2178.

［8］Patrono C.Aspirin as an antiplatelet drug［J］.New Engl J Med，1994，330（18）：1287-1294.

［9］Patrono C.The multifaceted clinical readouts of platelet inhibition by low-dose aspirin［J］.J Am Coll Cardiol，2015，66（1）：74-85.

［10］Hoffman EA，Gizelska K，Mirowski M，et al.Arsenic trioxide downregulates cancer procoagulant activity in MCF-7 and WM-115 cell lines in vitro［J］.Contemp Oncol（Pozn），2015，19（2）：108-112.

The inhibitory mechanism of arsenic trioxide on collagen-induced platelet aggregation△

LIU Zhi-ping#GUO Jun-feng CHEN Jie ZHANG Da-xin
Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

ObjectiveTo analyze whether arsenic trioxide has an effect on collagen-induced platelet aggregation and its potential mechanisms.Method Collagen was used to induce platelet aggregation.The inhibitory effects of arsenic trioxide on platelet aggregation were measured by light transmission aggregometry.The abundance of glycoprotein IIb/IIIa（GP IIb/IIIa）on the surface of the platelets during aggregation was measured by flow cytometry.The concentration of（thromboxane B2，TXB2）was measured by an enzyme immunoassay kit.ResultArsenic trioxide inhibited（thromboxane A2，TXA2）release from platelet during collagen-induced platelet aggregation.Arsenic trioxide did not affect GPIIb/ IIIa on the surface of the platelets in the course of platelet aggregation.ConclusionArsenic trioxide inhibits collagen-induced platelet aggregation through blocking TXA2 activation pathway.

platelet aggregation；arsenic trioxide；glycoprotein IIb/IIIa；thromboxane A2 Oncol Prog，2016，14（2）

R730.53

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.02.19

2015-08-10）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助（12521340）#

（corresponding author），郵箱：as150001@aliyun.com