等電點法提取酪蛋白的方法改進(jìn)

楊勇，徐志霞，黃循吟，汪繼超，王銳萍，張文飛

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南?？?71158）

等電點法提取酪蛋白的方法改進(jìn)

楊勇，徐志霞，黃循吟，汪繼超，王銳萍，張文飛*

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南海口571158）

為提高酪蛋白的提取效果，通過探究預(yù)先脫脂牛奶和未預(yù)先脫脂牛奶在不同pH（4.5、4.6、4.7、4.8、4.9）條件下沉淀酪蛋白的效果，得出了先離心脫脂，然后在pH 4.6的條件下進(jìn)行酪蛋白凝集，最后在離心管中懸浮沉淀洗滌，可以達(dá)到最佳的提取效果，得率和純度分別是98.58%和97.52%.實驗結(jié)果表明，該法操作簡單，可有效提高酪蛋白的提取效果和純度，縮短提取時間，實驗教學(xué)效果良好.

脫脂；酪蛋白；沉淀

牛奶的主要成分為蛋白質(zhì)，脂肪，乳糖和礦物質(zhì)等，均為人體代謝提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，被認(rèn)為是營養(yǎng)成分最為完善的食品之一[1].牛奶中的蛋白質(zhì)主要成分是酪蛋白，其含量大約在35 g/L，占總蛋白量的80%，因其所占的比例比較穩(wěn)定，受其他因素影響較小，根據(jù)這一性質(zhì)，可以用其判斷牛奶品質(zhì)[2].酪蛋白成分復(fù)雜，主要含有4個亞型：α1酪蛋白、α2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白.它們的純凈物為白色，無味的顆粒狀固體[3].

根據(jù)蛋白質(zhì)在其等電點溶解度最低的原理，在一定的溫度下，用緩沖液將牛奶的pH值調(diào)整到其等電點，酪蛋白即可以發(fā)生沉淀，酪蛋白不溶于水和有機(jī)溶劑，用蒸餾水和有機(jī)溶劑洗滌沉淀中的雜蛋白和脂類等其他物質(zhì)，便可得到較為純凈的酪蛋白[4].然而，傳統(tǒng)的方法常常會出現(xiàn)難以脫去全部的脂肪，得到的酪蛋白超出理論值，顏色發(fā)黃，純度較低的現(xiàn)象，又因為不同的文獻(xiàn)對等電點的說法也不一[1，4-6]，容易造成誤解.因此本研究通過改進(jìn)原有的脫脂方法，來尋求最合適等電點，提高酪蛋白的純度，為實驗教學(xué)提供參考依據(jù).

1　材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

分析天平（常州奧豪斯SE602），酸度計（美國丹佛UB-7），恒溫干燥箱（上海一恒），離心機(jī)（長沙湘儀TDZ4-WS），恒溫水浴鍋（金壇金南儀器HHW600）等.

95%乙醇、無水乙醚、乙醇乙醚混合物（1∶1）、0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH分別是4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，酪蛋白（A.R.），以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

250 mL伊利牌盒裝純牛奶（酪蛋白含量：3.1g/ 100mL），購于?？谑写鬂櫚l(fā)超市.

1.2方法

預(yù)先脫脂：量取牛奶20 mL置于50 mL離心管中，4000 r/min離心10 min，取出后用玻璃棒挑去牛奶上層的脂肪層.同時取未進(jìn)行脫脂的樣品作對照.

沉淀：將盛有牛奶的離心管置于40℃的水浴鍋中預(yù)熱，邊攪拌邊在不同離心管中分別加入pH值4.5、4.6、4.7、4.8、4.9的已在40℃預(yù)熱的醋酸鈉緩沖液，冷卻至室溫，然后4000 r/min離心5 min，沉淀既為酪蛋白粗品.

水洗：用20 mL蒸餾水懸浮沉淀并振蕩混勻，4000 r/min離心3 min后棄上清液，沉淀再重復(fù)水先2次.

再脫脂：用95%乙醇10 mL徹底懸浮沉淀并振蕩混勻，4000 r/min離心3 min，棄上清液后，用乙醇乙醚混合物（1∶1）洗滌沉淀2次，最后用無水乙醚再洗滌沉淀2次.

計算得率：將離心管中的沉淀置于50℃烘箱內(nèi)烘干2 h后稱量，計算出不同pH緩沖液沉淀酪蛋白的得率.

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取酪蛋白純品0.1 g溶于0.1 mol/mL的NaOH溶液中并定容100 mL，配制成1 mg/ mL的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液.以標(biāo)準(zhǔn)液分別配制2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的酪蛋白溶液，用0.1 mol/mL的NaOH溶液校零，測定各組在280 nm處的吸光值.以酪蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，280 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

純度測定:稱取樣品酪蛋白0.1 g溶于0.1 mol/ mL的NaOH溶液中并定容100 mL，測定溶液在280 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品中酪蛋白的含量.

2　結(jié)果與分析

2.1酪蛋白量的測定

以20 mL伊利牌純牛奶作為實驗材料，用pH值為4.5、4.6、4.7、4.8、4.9的醋酸-醋酸鈉緩沖液沉淀酪蛋白，預(yù)先脫脂和未預(yù)先脫脂的樣品各重復(fù)5次，提取酪蛋白的質(zhì)量見表1和表2.通過單因素方差分析，表明各pH組之間存在極顯著差異，預(yù)先脫脂和未預(yù)先脫脂提取量最多的pH均為4.6.

表1　預(yù)先脫脂，不同pH值緩沖液沉淀酪蛋白的量(g)Tab.1The recovery rate of casein from skimmed milk in buffer solutions with various pH value

表2　預(yù)先脫脂，不同pH值時，酪蛋白含量方差分析表Tab.2The ANOVA table for the content of casein from skimmed milk in buffer solution with various pH value

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)測得的數(shù)據(jù)，以酪蛋白濃度為橫坐標(biāo)，280 nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1.

2.3純度的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得預(yù)先脫脂和未預(yù)先脫脂的牛奶在各pH下提取酪蛋白的純度的平均值見表3.實驗結(jié)果表明，在不同pH值下沉淀的酪蛋白，預(yù)選脫脂提取的純度均高于未預(yù)先脫脂的純度.

3　討論

實驗結(jié)果表明，預(yù)先脫脂，并用pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沉淀酪蛋白得率最高，達(dá)到了0.611g/20 mL，得率達(dá)98.58%.實驗結(jié)果也表明，預(yù)先脫脂的純度高于未預(yù)先脫脂的純度.本法得到的酪蛋白均為白色粉末，顆粒較少.

由于該實驗全部操作過程都在離心管中進(jìn)行，采用蒸餾水和有機(jī)溶劑懸浮酪蛋白沉淀，再通過離心分離，省去了傳統(tǒng)方法中的抽濾洗滌脂肪[4]步驟，既減少了實驗過程中中間環(huán)節(jié)的損耗，又可以使蒸餾水和有機(jī)溶劑充分接觸酪蛋白粗品，提高了洗滌雜質(zhì)的效果，減少了實驗誤差.因此建議，在以后的教學(xué)過程中，可預(yù)先脫脂，再用pH 4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液沉淀酪蛋白，可以達(dá)到更好的實驗效果.

圖1　酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Casein standard curve

表3　未預(yù)先脫脂，不同pH值緩沖液下得到酪蛋白的量(g)Tab.3The recovery rate of casein from milk in buffer solutions with various pH value

表4　預(yù)先脫脂，不同pH值時，酪蛋白含量方差分析表Tab.4The ANOVA table for the content of casein from milk in buffer solution with various pH value

表5　預(yù)先脫脂和未預(yù)先脫脂提取酪蛋白的純度對比Tab.5The purity comparasion of casein extracted from milk and skimmed milk

[1]邵錦震,易理清.等電沉淀法分離酪蛋白方法的探討[J].湖北師范學(xué)院學(xué)報,2004,24(1):19-22.

[2]朱曉瑩,覃靖娟,朱日生,等.等電沉淀法提取酪蛋白的實驗方法改進(jìn)[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2013,31(9):93-94.

[3]周志偉,盛東生,許永紅,等.定量分析加熱后乳清蛋白與酪蛋白的結(jié)合[J].食品工業(yè)科技,2000,21(5):28-30.

[4]陳均輝,李俊.生物化學(xué)實驗[M].5版.北京:科學(xué)出版社, 2014:103-104.

[5]陳忠平.牛奶中酪蛋白和乳糖的分離[J].安徽技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2001,15(4):58-59.

[6]韓珍瓊,方建華.實驗室制備牛奶酪蛋白的技術(shù)研究[J].畜牧與飼料科學(xué),2010,31(8):83-85.

責(zé)任編輯：畢和平

The Optimization of Extracting Casein in the Isoelectric Point

YANG Yong，XU Zhixia，HUANG Xunyin，WANG Jichao，WANG Ruiping，ZHANG Wenfei*
（School of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

To improve the extraction of casein,this study explored extraction efficiency of casecn from milk and skimmd milk in different pH（4.5、4.6、4.7、4.8、4.9）.It concluded that casein from skimmed milk aggregated in pH 4.6 and then sus?pended and washed precipitate in the centrifuge tube,could achieve the best extraction results.The yield and purity were 98.58%and 97.52%respectively.This study simplified the experimental procedure,effectively raised the purity of casein, shortened the extraction time,and the effect of experimental teachingwas improved significantly.

skimmed；casein；precipitate

Q 503

A

1674-4942（2016）01-0109-03

2015-11-19

海南師范大學(xué)生物科學(xué)特色實驗教學(xué)示范中心項目