熊去氧膽酸對家兔保膽取石術(shù)后膽囊膽汁成分和膽囊組織中VIP和Calponin表達(dá)的影響

王　威，石　鑫，陳　虎，苗伏龍，秦琦瑜，陳進(jìn)軍

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050031)

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·論著·

熊去氧膽酸對家兔保膽取石術(shù)后膽囊膽汁成分和膽囊組織中VIP和Calponin表達(dá)的影響

王威，石鑫，陳虎，苗伏龍，秦琦瑜，陳進(jìn)軍

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050031)

目的探討熊去氧膽酸膠囊聯(lián)合保膽取石術(shù)對膽囊結(jié)石家兔模型術(shù)后膽汁成分及膽囊組織中血管活性腸肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)和調(diào)寧蛋白(calponin，Cap)表達(dá)的影響。方法選擇雄性新西蘭家兔60只作為研究對象，建立膽囊結(jié)石模型后進(jìn)行保膽取石術(shù)，根據(jù)術(shù)后處理方式不同分為3組，對照組給予普通飲食，模型組給予致石飲食，干預(yù)組給予致石飲食+熊去氧膽酸。檢測3組家兔血清中脂質(zhì)含量、膽汁中總膽固醇(total cholesterol，TC)和總膽酸(total bile acid,TBA)含量，以及膽囊組織中VIP和Cap的表達(dá)量。結(jié)果干預(yù)5周后，模型組家兔血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、TC、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量均高于對照組(P<0.05)；干預(yù)組家兔血清中TG、TC、LDL-C含量均低于模型組(P<0.05)；模型組家兔膽汁中TC含量高于對照組(P<0.05)；干預(yù)組膽汁中TC低于模型組(P<0.05)但高于對照組；干預(yù)組家兔膽汁中TBA含量高于模型組及對照組(P<0.05)；模型組家兔膽囊組織中VIP、Cap含量高于對照組(P<0.05)；干預(yù)組家兔膽囊組織中VIP和Cap蛋白含量低于模型組(P<0.05)。結(jié)論熊去氧膽酸膠囊干預(yù)能夠調(diào)節(jié)膽囊結(jié)石家兔模型保膽取石術(shù)后的膽汁成分，減少膽道舒張物質(zhì)VIP和Cap的表達(dá)。

膽囊結(jié)石?。荒懩以炜谛g(shù)；熊去氧膽酸

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.006

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of ursodeoxycholic acid combined with gallbladder protected lithotomy on postoperative bile composition and muscle composition in rabbit model of gallbladder stones. MethodsSixty male New Zealand rabbits were chosen as research subjects, endoscopic gallbladder protected lithotomy were conducted after gallstones model were made, randomly divided into three groups according to postoperative treatment, the control group received normal diet, the model group received lithogenic diet, the intervention group received lithogenic diet+ursodeoxycholic acid. Then serum lipid contents, bile total cholesterol(TC) and total bile acid(TBA), calponin(Cap) and vasoactine intrestinal peptide(VIP) expression in biliary smooth muscle were detected. ResultsAfter five weeks of intervention, serum triglyceride(TG), TC, low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) contents in model group rabbits were higher than that in the control group(P<0.05). Serum TG, TC, LDL-Cl contents in intervention group were lower than that in model group(P<0.05). Bile TC contents model group rabbits were higher than that in the control group(P<0.05); bile TC contents in intervention group were lower than that in the model group and were highter than that in the control group (P<0.05); bile TBA contents in intervention group were higher than that in the control group and the model group (P<0.05) . VIP and Cap in model group gallbladder tissue were higher than that in the control group(P<0.05). VIP and Cap in intervention group gallbladder tissue were lower than that in the model group(P<0.05).ConclusionUrsodeoxycholic acid capsule interventions can regulate bile components and reduce expression of Cap and VIP in rabbit model of gallbladder stones received gallbladder protected lithotomy.

十幾年前，國內(nèi)學(xué)者張寶善[1]提出了保膽取石術(shù)，該手術(shù)的優(yōu)勢是既避免了對膽管及周圍器官的醫(yī)源性損傷，又減輕了手術(shù)給患者帶來的痛苦，術(shù)后恢復(fù)快。但是保膽取石術(shù)后存在膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)的風(fēng)險，如何預(yù)防膽囊結(jié)石形成和復(fù)發(fā)是臨床面臨的重要課題。熊去氧膽酸是由多個羥基組成的有機(jī)化合物，具有促進(jìn)內(nèi)源性膽汁酸分泌、拮抗疏水性膽汁酸的作用，可達(dá)到預(yù)防結(jié)石形成的目的[2]。國內(nèi)學(xué)者從膽囊運動功能、預(yù)防復(fù)發(fā)展開研究。本研究通過建立膽囊結(jié)石家兔模型，分析熊去氧膽酸膠囊聯(lián)合保膽取石術(shù)對膽囊結(jié)石家兔模型術(shù)后膽汁成分及膽囊組織中血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、調(diào)寧蛋白(calponin,Cap)表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物由河北省實驗動物中心提供雄性新西蘭家兔60只(合格證號：2014-0008)，3～4月齡，體質(zhì)量1 800～2 200 g，隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組各20只，各組家兔年齡、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本次研究報經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要藥物、儀器與試劑①致石飲食：高總膽固醇(total cholesterol，TC)飼料(1.2%的TC，98.8%的普通飼料)由河北省實驗動物中心提供；熊去氧膽酸：上海三維長江生化制藥廠，國藥準(zhǔn)字H31021950，規(guī)格50 mg×60片。②儀器：日本日立公司7600型全自動生化分析儀；美國通用公司LOGIQ9型動物用便攜式B超；美國Beckman公司J-30I高速冷凍離心機(jī)；美國Pharmacia Biotech公司紫外光柵分光光度計；美國Nicolet公司Mgna FIIR-750型紅外光譜儀；美國Bio-Rad公司Power PAC300電泳儀與Power PAC電轉(zhuǎn)儀；上海浦江分析儀器廠ML-902定量恒溫磁力攪拌器。③試劑： ECL蛋白免疫印跡檢測試劑購自Amersham公司；苯甲基磺酸氟購自上海申能博彩有限公司，VIP、Cap抗體購自武漢博士生物工程有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1家兔膽囊結(jié)石模型建立健康成年雄性家兔60只，室溫23 ℃左右予以致石飲食喂養(yǎng)5周。

1.3.2分組實施干預(yù)根據(jù)Juniper制定的標(biāo)準(zhǔn)劃分，把生成不同等級的膽固醇結(jié)晶級膽囊結(jié)石的家兔平均分配到各組中，并予以不同的干預(yù)，對照組給予普通飲食，模型組給予致石飲食，干預(yù)組給予致石飲食+熊去氧膽酸。各組家兔均1 d分2次灌胃。

1.3.3內(nèi)鏡下保膽取石術(shù)3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(30 mg/kg)。無菌操作。上腹正中切口進(jìn)腹，注射器抽凈膽汁后，5-0尼龍無損傷針線于膽囊底做一直徑4 mm的荷包縫合切口，反復(fù)探查取凈膽囊內(nèi)結(jié)石，拉緊縫線結(jié)扎。生理鹽水清洗后，關(guān)腹。

1.3.4膽固醇結(jié)晶及結(jié)石的觀測取新鮮膽汁滴在載玻片上偏振光顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶。 打開膽囊直接肉眼觀察,若膽汁內(nèi)存在成形、粗大顆粒者定為結(jié)石。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血脂測定干預(yù)后3周和5周時，經(jīng)耳緣靜脈采血，應(yīng)用全自動生化分析儀測定三酰甘油(triglyceride，TG)、TC、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。

1.4.2膽汁測定干預(yù)后5周時，均禁食水12 h后，3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(30 mg/kg)，而后將兔仰臥位固定于兔臺上，局部脫毛，打開腹腔后分離膽囊，采集膽汁并應(yīng)用全自動生化分析儀測定TC、總膽汁酸(total bile acid,TBA)含量。

1.4.3膽囊運動相關(guān)分子蛋白表達(dá)取膽囊組織100 mg，加入1 mL細(xì)胞裂解液(radio-immunopreci pitation assay， RIPA)與10 μL苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride,PMSF)提取總蛋白15 μg，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。室溫溫育1 h，加入VIP、Cap蛋白抗體，37 ℃溫育1～2 h，辣根過氧化物酶聯(lián)試劑37 ℃溫育1 h。PSB溶液洗滌，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，X線處記錄影像。置于圖像掃描儀下掃描，應(yīng)用自帶分析軟件分析光密度。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1各組血清中脂質(zhì)成分含量比較干預(yù)5周后，模型組家兔血清中TG、TC、LDL-C含量均明顯高于對照組(P<0.05)；干預(yù)組血清中TG、TC、LDL-C含量均低于模型組，但仍高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2各組膽汁中TC、TBA和膽囊組織中VIP、Cap含量比較干預(yù)5周后，模型組家兔膽汁中TC含量明顯高于對照組，干預(yù)組明顯低于模型組，但仍高于對照組(P<0.05)；干預(yù)5周后，模型組TBA含量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)組家兔膽汁中TBA含量均明顯高于模型組和對照組(P<0.05)；模型組家兔膽囊組織中VIP和Cap表達(dá)量高于對照組(P<0.05)；干預(yù)組家兔膽囊組織中VIP和Cap表達(dá)量低于模型組，但仍高于對照組(P<0.05)。見表2。

表13組家兔干預(yù)5周后血清脂質(zhì)含量比較

組別TGTCLDL-C對照組2.49±0.273.60±0.411.55±0.17模型組5.69±0.62*7.94±0.91*3.85±0.42*干預(yù)組3.15±0.39*#4.92±0.55*#2.01±0.22*#F13.28211.39214.482P0.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

表23組家兔干預(yù)5周后膽汁中TC、TBA含量和膽囊組織中VIP、Cap比較

組別膽汁TC(mmol/L)TBA(μmol/L)膽囊組織VIP(%)Cap蛋白(%)對照組3.49±0.405.24±0.59100.00±12.89100.00±13.57模型組7.41±0.79*5.02±0.52254.68±30.15*287.58±34.22*干預(yù)組4.02±0.47*#9.44±1.03*#134.22±15.47*#140.18±16.22*#F9.17510.33815.86614.492P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

3　討　　論

我國膽囊結(jié)石發(fā)病率為10%左右，是一種常見病、多發(fā)病。1882年，Langenouch所創(chuàng)膽囊切除術(shù)治療膽囊結(jié)石延續(xù)至今，近20多年，腹腔鏡膽囊切除術(shù)曾一度被尊為膽囊結(jié)石治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。但隨著膽囊切除術(shù)的推廣以及在臨床中的大量應(yīng)用，越來越多的學(xué)者認(rèn)識到該手術(shù)方式存在一定的弊端，如膽囊切除術(shù)有可能造成膽汁反流性胃炎、消化不良膽囊切除術(shù)后綜合征，并有可能增加術(shù)后結(jié)腸癌的發(fā)生率[3-5]。膽囊切除術(shù)后的并發(fā)癥有黃疽、出血、膽漏、急性腹膜炎、急性胰腺炎、結(jié)石殘余等，若處理不當(dāng),后果嚴(yán)重,甚至危及生命[6]。膽囊切除術(shù)造成膽管損傷占0.18%～2.3%，病死率占0.17%[7]，其帶來的后遺癥也是災(zāi)難性的。近10余年來，在我國蓬勃興起的膽囊取石術(shù)(即通常稱謂的“保膽取石術(shù)”)已對傳統(tǒng)的膽囊切除術(shù)提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。但保膽取石術(shù)后存在一定結(jié)石復(fù)發(fā)問題[8]。膽囊結(jié)石的形成機(jī)制是遺傳、環(huán)境、飲食、基因、脂類代謝等多因素共同作用的結(jié)果。而保膽取石并未去除形成結(jié)石的因素，未阻斷形成結(jié)石的機(jī)制[9-10]。盡管如此，內(nèi)鏡下保膽取石術(shù)確實存在諸多方面的優(yōu)點，正在逐步為外科醫(yī)師所接受。因此，如何預(yù)防保膽取石術(shù)后膽囊結(jié)石的復(fù)發(fā)成為了臨床研究的熱點。

膽固醇結(jié)石是膽囊結(jié)石最主要的類型，其形成機(jī)制是膽汁內(nèi)TC含量過高、TC與TBA比例失調(diào)、膽道動力學(xué)異常等[7]。膽汁中TC濃度過飽和是膽囊膽固醇結(jié)石形成的最主要的生理變化[11]。而膽汁中TC成分的增加會增加膽囊平滑肌細(xì)胞膜的TC含量和TC/磷脂比率，使磷脂的脂肪酰鏈形成空間巨大的運動阻礙。胞膜會增厚、僵硬，可引起膜蛋白功能的破壞，從而影響膽囊平滑肌的收縮功能[12]。熊去氧膽酸也稱3α,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，口服后能夠迅速在空腸與回腸前部被動轉(zhuǎn)運吸收，于回腸末端主動轉(zhuǎn)運吸收，半衰期為3.5～5.8 d。通過抑制TC在腸道內(nèi)的吸收與降低TC向膽汁分泌，可使膽囊結(jié)石溶解[13]。動物實驗表明，借助熊去氧膽酸親水性、無細(xì)胞毒性以及對細(xì)胞的保護(hù)作用，替代親脂性、去污劑樣毒性膽汁酸，且具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用[14]。熊去氧膽酸能夠增加膽汁酸的分泌，可利膽、抑制肝臟TC的合成、減少腸道TC的吸收、增加TC轉(zhuǎn)換為膽汁酸、使膽汁中TC減少。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)5周后，模型組家兔血清中TC以及膽汁中TG、TC、LDL-C含量均高于對照組，說明在膽石癥的發(fā)生過程中，膽汁和血清中的脂質(zhì)成分發(fā)生改變；干預(yù)組膽汁中TC含量以及血清中TG、TC、LDL-C含量均明顯低于模型組，但仍高于對照組；干預(yù)組膽汁中TBA含量均高于對照組和模型組。國內(nèi)外學(xué)者也有類似的文獻(xiàn)報道[3，15]。提示熊去氧膽酸干預(yù)能夠降低血脂含量以及膽汁中TC含量，促進(jìn)內(nèi)源性膽汁酸分泌，并抑制其重吸收，從而調(diào)節(jié)膽汁中TC和TBA的比例，進(jìn)而預(yù)防膽囊結(jié)石的形成。

膽囊是貯存和濃縮膽汁的器官，能夠進(jìn)行節(jié)律性和緊張性收縮，膽囊的活動以及Oddi括約肌的活動相互配合和協(xié)調(diào)。Oddi括約肌收縮時膽囊舒張，膽汁進(jìn)入膽囊并貯存；Oddi括約肌舒張時膽囊收縮，膽汁進(jìn)入腸道[16]。VIP和Cap是調(diào)節(jié)Oddi括約肌以及膽囊收縮和舒張狀態(tài)的兩類物質(zhì)。VIP和Cap能夠抑制平滑肌的收縮并使平滑肌處于舒張狀態(tài)。當(dāng)VIP和Cap合成和分泌增多時，膽囊處于舒張狀態(tài)，膽汁無法及時排出并大量蓄積，該狀態(tài)長期存在會導(dǎo)致膽囊結(jié)石的形成[17-18]。本研究模型組家兔膽囊組織中VIP和Cap表達(dá)高于對照組；干預(yù)組家兔膽囊組織中VIP和Cap表達(dá)低于模型組,但仍高于對照組。與沈陽等[19]文獻(xiàn)報道基本相似。說明膽石癥的發(fā)生與VIP和Cap的高表達(dá)有關(guān)，熊去氧膽酸有助于降低VIP和Cap的高表達(dá)。

綜上所述，熊去氧膽酸膠囊干預(yù)能夠調(diào)節(jié)膽囊結(jié)石家兔模型保膽取石術(shù)后的膽汁成分，減少膽道舒張物質(zhì)VIP和Cap的表達(dá)，可預(yù)防保膽取石術(shù)后膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)。因本研究可供參考的文獻(xiàn)較少，且沒有對術(shù)后膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)情況進(jìn)行比較分析，可能會影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，有待于今后開展更多基礎(chǔ)和臨床研究加以求證。

[1]張寶善.內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽取石術(shù)治療膽囊結(jié)石[J].中國內(nèi)鏡雜志,2002,8(7):7-10.

[2]Lammers WJ,Hirschfield GM,Corpechot C,et al. Development and validation of a scoring system to predict outcomes of patients with primary biliary cirrhosis receiving ursodeoxycholic acid therapy[J]. Gastroenterolgoy,2015,149(7):1804-1812，e4.

[3]陳建飛，趙期康，李晉忠，等.?；切苋パ跄懰崤c熊去氧膽酸對預(yù)防保膽術(shù)后結(jié)石復(fù)發(fā)的臨床研究[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2014,14(4):311-313.

[4]祁夫魁.腹腔鏡輔助膽道鏡保膽取石術(shù)結(jié)合優(yōu)思弗治療膽囊結(jié)石的臨床研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2012,33(4):643-644.

[5]韓艷慶,劉媛,戚峰.膽囊結(jié)石或膽囊切除術(shù)與大腸癌關(guān)系的Meta分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2012,18(1):17-20.

[6]譚一慰.膽囊切除術(shù)后近期黃疸發(fā)生的原因及處理[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,33(12):1441-1443.

[7]侯元凱，李振華，王偉智，等.239例腹腔鏡聯(lián)合膽道鏡保膽取石術(shù)后3年臨床隨訪分析[J].中國內(nèi)鏡雜志，2014,20(12):1268-1271.

[8]譚智明，張鵬，趙運平，等.?；切苋パ跄懰峤Y(jié)合微創(chuàng)保膽取石術(shù)在膽囊結(jié)石治療的作用分析[J].肝膽外科雜志，2014,22(4):292-294.

[9]王賓，劉振杰，呂云霄，等.術(shù)前與術(shù)中內(nèi)鏡下括約肌切開術(shù)治療膽囊結(jié)石合并膽總管結(jié)石的薈萃分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015,95(18):1425-1429.

[10]Kramp KH,van Det MJ,Totte ER,et al. Ergonomic assessment of the French and American position for laparoscopic cholecystectomy in the MIS Suite[J]. Surg Endosc,2014,28(5):1571-1578.

[11]王春城,張萬星,曹月敏.膽囊結(jié)石與糖尿病的關(guān)系[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,36(11):1362-1364.

[12]文輝清,時鑫.膽囊平滑肌的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2013,10(20):152-155.

[13]劉榮.聯(lián)合用藥治療妊娠期肝內(nèi)膽汁瘀積癥對母嬰結(jié)局的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,34(5):585-587.

[14]Deitz KL,Makielski KM,Williams JM,et al. Effect of 6-8 weeks of oral ursodeoxycholic acid administration on serum concentrations of fasting and postprandial bile acids and biochemical analytes in healthy dogs[J]. Vet Clin Pathol,2015,44(3):431-436.

[15]Zha J,Badri PS,Ding B,et al. Drug interactions between hepatoprotective agents ursodeoxycholic acid or glycyrrhizin and ombitasvir/paritaprevir/ritonavir in healthy japanese subjects[J]. Clin Ther,2015,37(1):2560-2571.

[16]高成生，秦成坤，耿文茂，等.膽道口括約肌運動功能與豚鼠膽固醇結(jié)石形成關(guān)系的研究[J/CD].中華普通外科學(xué)文獻(xiàn):電子版，2015,9(5):346-350.

[17]Krawczyk M,Rusticeanu M,Grünhage F,et al. Analysis of the common vasoactive intestinal peptide receptor 1 polymorphism in gallstone patients[J]. J Gastrointetin Liver Dis,2010,19(1):273-277.

[18]楊建鋒，王霞，王暉，等.十二脂腸乳頭括約肌切開術(shù)對Oddi括約肌功能的影響及遠(yuǎn)期并發(fā)癥的關(guān)系[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2014,31(1):5-8.

[19]沈陽，丁佑銘，呂仁更，等.膽囊結(jié)石形成時Calponin、VIP在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達(dá)及意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(5)：524-526.

(本文編輯：許卓文)

Effect of ursodeoxycholic acid combined with gallbladder protected lithotomy on postoperative bile composition and expression of Calponin and VIP in biliary smooth muscles

WANG Wei, SHI Xin, CHEN Hu, MIAO Fu-long, QIN Qi-yu, CHEN Jin-jun

(Department of Liver and Gallbladder surgery, the First Hospital of Hebei Medical university,Shijiazhuang 050031, China)

cholecystolithiasis; cholecystostomy; ursodeoxycholic acid

2016-01-21；

2016-04-06

王威(1981-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第

R735.7

A

1007-3205(2016)09-1014-04

一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝膽外科疾病診治研究。