HPLC-APCI-MS/MS法測定與口接觸玩具及兒童用品中14種可遷移N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)

黃理納，李函珂，蟻樂洲，彭　峰，李　瓊

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州　510623；2.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州　510640)

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HPLC-APCI-MS/MS法測定與口接觸玩具及兒童用品中14種可遷移N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)

黃理納1，李函珂2，蟻樂洲1，彭峰2，李瓊2

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州510623；2.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州510640)

建立了高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-APCI-MS/MS)法測定與口接觸玩具及兒童用品中14種可遷移N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)。樣品在人工唾液中模擬口腔接觸后，一部分遷移液用于可遷移N-亞硝胺的分析，另一部分經(jīng)亞硝化后用于可遷移N-亞硝化物質(zhì)的分析。實(shí)驗(yàn)還對電離源類型、多重反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)、離子源參數(shù)、色譜柱類型、梯度洗脫程序、甲酸濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：14種目標(biāo)物在0.2～100 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 5，方法檢出限為0.32～1.0 μg/kg；在5、50、500 μg/kg加標(biāo)濃度水平的回收率為82.3%～122%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～13.9%(n=5)。實(shí)驗(yàn)抽查了104個批次市場樣品，包括橡膠和硅膠奶嘴、氣球以及其他橡膠制品，陽性率為7.4%。在抽查分析的8批次氣球樣品中，有4批次N-亞硝胺遷移量和6批次可N-亞硝化物質(zhì)遷移量超出了歐盟玩具安全指令2009/48/EC規(guī)定的遷移限量，陽性率高達(dá)75%，說明氣球樣品的風(fēng)險(xiǎn)最高。

玩具；兒童用品；與口接觸；可遷移；N-亞硝胺；可N-亞硝化物質(zhì)；高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-APCI-MS/MS)

人群的流行病學(xué)調(diào)查表明，N-亞硝胺可通過皮膚、呼吸道和消化道進(jìn)入人體，某些N-亞硝胺可與生物大分子(如DNA)以共價(jià)鍵結(jié)合的形式形成加合物，改變DNA的性質(zhì)，從而引發(fā)癌癥[2]。人類的某些癌癥，如胃癌、食道癌、肝癌、結(jié)腸癌等可能與其有關(guān)[3]。2009～2015年，歐盟非食品類消費(fèi)品快速預(yù)警系統(tǒng)共通報(bào)了13起因N-亞硝胺或可N-亞硝化物質(zhì)的遷移量超標(biāo)而被召回的玩具，其中12起涉及氣球產(chǎn)品，說明氣球具有較高風(fēng)險(xiǎn)。玩具及兒童用品作為我國出口歐盟的大宗商品之一，對N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)超標(biāo)具有較高的敏感性，而氣球又是其中最為敏感的產(chǎn)品之一，應(yīng)引起高度重視。1993年歐盟93/11/EC指令[4]、2007年德國法規(guī)[5]以及2009年歐盟2009/48/EC指令[6]，都對橡膠制品的N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)的遷移量進(jìn)行了限制。其中，歐盟2009/48/EC指令規(guī)定，玩具及兒童用品中N-亞硝胺遷移量不得超過0.05 mg/kg，可N-亞硝化物質(zhì)遷移量不得超過1 mg/kg。2012年，我國在GB 28482—2012中規(guī)定[7]，奶嘴中可遷移N-亞硝胺不得超過0.01 mg/kg，可N-亞硝化物質(zhì)的遷移量不得超過0.1 mg/kg。

目前，N-亞硝胺的分析方法主要有氣相色譜(GC)法和液相色譜(LC)法。GC可提供較好的分離度，但分析前需使用二氯甲烷等有機(jī)溶劑對N-亞硝胺進(jìn)行萃取，前處理步驟復(fù)雜，且只適于分離易揮發(fā)的N-亞硝胺，其應(yīng)用受到一定程度的限制。LC不僅能夠分離難揮發(fā)的N-亞硝胺，而且能夠直接分析水相，無需有機(jī)溶劑萃取，簡化了樣品的前處理步驟；但其分離度較低，不能分離某些N-亞硝胺同分異構(gòu)體。熱能分析儀(TEA)作為一種N-亞硝胺的特異型檢測器，其靈敏度高、選擇性強(qiáng)、受基質(zhì)干擾小，是一些國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法[8]。但該檢測器只適用于含亞硝基化合物的檢測，且設(shè)備昂貴，其使用受到了一定的限制。單級質(zhì)譜(MS)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)也可用于N-亞硝胺的檢測。單級質(zhì)譜常與氣相色譜聯(lián)用，采用電子轟擊源(EI)或化學(xué)電離源(CI)對N-亞硝胺進(jìn)行電離。使用EI源時(shí)，某些低質(zhì)量N-亞硝胺的響應(yīng)較低，且易受基體干擾，譜圖特異性不強(qiáng)，定性和定量存在一定困難[9]。串聯(lián)質(zhì)譜則使用特定的離子對進(jìn)行定性和定量分析，具有選擇性強(qiáng)，可解決單級質(zhì)譜背景復(fù)雜和干擾嚴(yán)重的問題，更適于同時(shí)分析多個目標(biāo)物。將串聯(lián)質(zhì)譜與液相色譜聯(lián)用，線性范圍可達(dá)3～5個數(shù)量級。Kim等[10]建立的HPLC-ESI-MS/MS法以甲酸-甲醇作為流動相，對煙草中的N-亞硝胺進(jìn)行分析，檢出限可達(dá)0.1 μg/L；Herrmann等[11]考察了不同電離源對N-亞硝胺靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)在分析標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用電噴霧電離源(ESI)得到的響應(yīng)略高，但大氣壓化學(xué)電離源(APCI)受基體的影響較小，抗干擾能力較強(qiáng)，更適用于實(shí)際樣品的分析；Krauss等[12]采用高分辨質(zhì)譜(LIT Orbitrap MS)法對9種N-亞硝胺對應(yīng)的母離子和子離子的分子質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，得到了子離子的分子式，定性能力進(jìn)一步提高。

本研究將采用HPLC-APCI-MS/MS法同時(shí)測定與口接觸玩具及兒童用品中14種N-亞硝胺，如N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)、N-亞硝基二乙醇胺(N-nitrosodiethanolamine, NDELA)、N-亞硝基嗎啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)、N-亞硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)、N-亞硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)、N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)、N-亞硝基二丙胺(N-nitrosodipropylamine, NDPA)、N-亞硝基二異丙胺(N-nitrosodiisopropylamine, NDiPA)、N-亞硝基-N-甲基-N-苯胺(N-nitroso-N-methyl-N-phenylamine, NMPhA)、N-亞硝基-N-乙基-N-苯胺(N-nitroso-N-ethyl-N-phenylamine, NEPhA)、N-亞硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine, NDBA)、N-亞硝基二異丁胺(N-nitrosodiisobutylamine, NDiBA)、N-亞硝基二芐基胺(N-nitrosodibenzylamine, NDBzA)、N-亞硝基二異壬基胺(N-nitrosodinonylamine, NDiNA)，其結(jié)構(gòu)式示于圖1。通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，使該方法能夠滿足德國法規(guī)的限量要求(N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)的遷移限量分別不得超過0.01 mg/kg和0.1 mg/kg)，并通過空白加標(biāo)和實(shí)際樣品分析對本方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有60 MPa二元泵；API3200型三重四極桿質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有電噴霧和大氣壓化學(xué)電離源；SW23型恒溫水浴振蕩搖床：德國 Julabo公司產(chǎn)品；Milli-Q Direct超純水機(jī)：德國Merck Millipore公司產(chǎn)品。

13種N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，NDMA(≥99.5%)、NDELA(≥97.7%)、NMOR(≥99.5%)、NPIP(≥99.5%)、NDEA(≥99.9%)、NPYR(≥98.0%)、NDPA(≥99.1%)、NDiPA(≥99.5)、NMPhA(≥98.7%)、NEPhA(≥98.0%)、NDBA(≥99.1%)、NDiBA(≥99.5%)、NDBzA(≥98.0%)：均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；NDiNA(≥98.0%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：購自加拿大TRC公司；亞硝酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；甲醇(色譜純)：購自美國Fisher公司；甲酸(色譜純)：購自德國CNW公司；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q Direct超純水機(jī)制備，電阻率為18.2 MΩ·cm，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

圖1　14種N-亞硝胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structures of 14 N-nitrosamines

與口接觸玩具及兒童用品均為出入境檢驗(yàn)抽查樣品，共104個批次。

1.2樣品前處理

1.2.1人工唾液的配制參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)EN12868：1999[7]配制，將4.2 g碳酸氫鈉、0.5 g氯化鈉、0.2 g碳酸鉀和0.03 g亞硝酸鈉溶于超純水中，加水稀釋至900 mL，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 9.0，然后，將溶液轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，加水定容至刻度，即得人工唾液。人工唾液現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前需預(yù)熱至(40±2) ℃。

1.2.2樣品的遷移參考EN 71-12:2013[13]中樣品的處理方法，對于氣球樣品，沿軸向進(jìn)行多次對稱裁剪，剪至約1 cm×1 cm碎片；稱量3.5～4.5 g氣球碎片于50 mL錐形瓶中，加入10倍于其質(zhì)量的已經(jīng)預(yù)熱至(40±2) ℃的人工唾液，確保樣品完全浸沒后，塞緊瓶塞，將錐形瓶置于(40±2) ℃恒溫水浴中，避光靜置1 h；靜置結(jié)束后，立即用2 mL注射器抽取遷移溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，置于棕色瓶中，待測。對于除氣球外的其他橡膠樣品，從其橡膠部分剪下表面積不低于10 cm2的樣品用于測試，若橡膠部分表面積小于10 cm2，則將其全部剪下，剪下部分的質(zhì)量不低于0.2 g；準(zhǔn)確稱取剪下的試樣(精確至0.01 g)于50 mL具塞錐形瓶中，加入10倍于其質(zhì)量的已預(yù)熱至(40±2) ℃的人工唾液，確保樣品被完全浸沒；塞緊瓶塞，將錐形瓶置于(40±2) ℃恒溫水浴中，避光靜置(240±3) min后，立即將遷移溶液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的玻璃瓶中，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中，待測。

1.2.3遷移液的亞硝化取1.2.2節(jié)制得的5 mL遷移液于25 mL棕色錐形瓶中，加入0.5 mL 1 mol/L稀鹽酸，塞緊瓶塞，在(40±2) ℃恒溫水浴中避光靜置30 min，隨后向遷移液中加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液；用2 mL注射器抽取上述溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后置于棕色瓶中，待測。

1.2.4N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取適量的N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以甲醇為溶劑，配制濃度為1 000 μg/L的14種N-亞硝胺儲備溶液，并于-18 ℃下避光保存；用人工唾液逐級稀釋儲備液，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃下避光保存于棕色瓶中。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Poroshell 120 EC-C18反相柱(100 mm×2.1 mm×2.7 μm)；流動相：甲醇(含0.01%甲酸)-水(含0.01%甲酸)溶液；梯度洗脫程序：甲醇的起始比例為10%，在10 min內(nèi)線性變化至98%，保持3 min，在0.1 min內(nèi)線性變化至10%，保持4.9 min，總分析時(shí)長為18 min；每次分析結(jié)束后，以甲醇-水溶液(1∶9，V/V)平衡系統(tǒng)4 min；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積40 μL；柱溫40 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，正離子模式；離子源溫度250 ℃；電暈放電針電流 3 μA；離子源輔助霧化氣和碰撞氣均為超純氮?dú)?，壓力分別為0.138 MPa和0.028 MPa；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描，Q1和Q3四極桿質(zhì)量分辨率不小于0.7 Da；每個MRM過程的駐留時(shí)間為100 ms，每個化合物選取2個MRM過程進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測，其中響應(yīng)較強(qiáng)的離子對用于定量，較弱的離子對用于定性；使用Analyst 1.5.2軟件進(jìn)行批處理和數(shù)據(jù)采集；依據(jù)對應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間和2個MRM過程色譜峰的豐度比對樣品中的N-亞硝胺進(jìn)行定性，外標(biāo)法峰面積定量。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1電離源的選擇電噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源是液質(zhì)聯(lián)用中常用的兩種電離源。Kim和Herrmann等[9-10]報(bào)道了在ESI正離子模式下可對一些N-亞硝胺化合物進(jìn)行分析，且在分析標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用ESI源得到的響應(yīng)要略高于APCI源。文獻(xiàn)[14-16]也報(bào)道了使用ESI源對N-亞硝胺進(jìn)行測定，得到的結(jié)果令人滿意。并且，Ripolles等[14]進(jìn)一步指出，APCI模式下N-亞硝胺色譜峰的信噪比更高，同時(shí)峰型也得到了改善。本研究考察了ESI正離子模式下14種N-亞硝胺的儀器響應(yīng)(峰面積)，并對各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。使用相同的流動相、流速、進(jìn)樣體積和梯度洗脫程序分析 100 μg/LN-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將每個目標(biāo)物在APCI模式下的儀器響應(yīng)定義為100%，ESI模式下得到的各目標(biāo)物的相對儀器響應(yīng)列于表1。可見，在ESI模式下，只有NDiNA的儀器響應(yīng)高于APCI模式下的儀器響應(yīng)，而其余13種N-亞硝胺的儀器響應(yīng)均低于APCI模式。此外，考慮到本研究中的14種N-亞硝胺大多屬于中等極性或弱極性化合物，更適于在APCI模式下電離，加之APCI的抗干擾能力更強(qiáng)，受樣品基體的影響更小[11]，因此最終選擇APCI作為電離源。

表1　ESI模式下，14種N-亞硝胺的儀器響應(yīng)相對值

2.1.2MRM參數(shù)的優(yōu)化用玻璃注射器吸取適當(dāng)濃度的N-亞硝胺單標(biāo)溶液，以50 μL/min的流速直接進(jìn)樣，分別對14種N-亞硝胺的MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果列于表2。

2.1.3離子源參數(shù)的優(yōu)化使用APCI源時(shí)，目標(biāo)物的分析靈敏度很大程度上取決于在離子源中形成的[M+H]+氣相離子的數(shù)量，而其又取決于離子源加熱器溫度(TEM)、輔助氣(GS1)壓力及電暈放電針電流(NC)，因此需對這3個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，為盡量減少非目標(biāo)分析物對檢測造成的干擾，并維持較高的響應(yīng)值，需要對氣簾氣(CUR)壓力進(jìn)行優(yōu)化。此外，為確保14種N-亞硝胺在碰撞池內(nèi)能夠產(chǎn)生表2中所列的子離子，并獲得較高的響應(yīng)值，需要對碰撞氣(CAD)壓力進(jìn)行優(yōu)化。本研究采用流動注射分析(flow injection analysis, FIA)法對每個N-亞硝胺涉及的離子源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置流速為0.3 mL/min，對濃度為100 μg/L含有14種N-亞硝胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液按表3所列的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，每個參數(shù)重復(fù)測定2次，每次進(jìn)樣5 μL，分析時(shí)間30 s，優(yōu)化結(jié)果列于表4。最終設(shè)置實(shí)際分析參數(shù)為TEM 250 ℃，GS1 0.138 MPa，NC 4 μA，CUR 0.103 MPa，CAD 0.027 6 MPa。

表2　14種N-亞硝胺的MRM參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

注：名義質(zhì)量(niminal mass)是指化合物的平均相對分子質(zhì)量(考慮同位素豐度)；Q表示響應(yīng)較強(qiáng)的離子，用于定量；q表示響應(yīng)較弱的離子，用于定性

表3　離子源參數(shù)優(yōu)化設(shè)定

表4　14種N-亞硝胺的離子源參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇在本實(shí)驗(yàn)分析的14種N-亞硝胺中，NDPA與NDiPA，NDBA與NDiBA互為同分異構(gòu)體，它們具有幾乎相同的MRM過程(在0.7 Da的質(zhì)量分辨率下不能區(qū)分)。為了準(zhǔn)確地定性和定量，二者的色譜峰必須基線分離。為此，選取Eclipse XDB-C18(150 mm×2.1 mm×3.5 μm)、Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Poroshell 120 EC-C18(100 mm×2.1 mm×2.7 μm)反相柱，在相同的梯度洗脫程序下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于XDB-C18為150 mm柱，為降低分析時(shí)間，將其流速提高至0.5 mL/min。使用上述色譜柱分析濃度為1 μg/L含有14種N-亞硝胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的NDPA與NDiPA、NDBA與NDiBA提取離子色譜圖示于圖2。

由圖2可見，3種色譜柱都能得到較好的峰型，NDPA和NDiPA均可實(shí)現(xiàn)基線分離，但使用填料尺寸較大的Eclipse XDB-C18色譜柱時(shí)，NDBA和NDiBA不能基線分離；而填料尺寸較小的Poroshell 120 EC-C18和Eclipse Plus C18色譜柱對NDBA和NDiBA的分離效果較好。這是由于目標(biāo)物在該類色譜柱中的擴(kuò)散相對較小、色譜峰變窄、峰高變大、分離度和靈敏度更高。在實(shí)際分析中，Eclipse Plus C18柱在梯度洗脫過程中的壓力接近系統(tǒng)壓力上限(60 MPa)，隨著無機(jī)鹽在色譜柱中逐漸累積，會造成系統(tǒng)壓力超出上限；而使用Poroshell 120 EC-C18柱時(shí)，系統(tǒng)壓力顯著降低，因此本研究選擇該色譜柱進(jìn)行樣品分析。

注：(1) Eclipse Plus C18；(2) Poroshell 120 EC-C18；(3) Eclipse XDB-C18圖2　使用不同色譜柱得到的NDPA與NDiPA(a)和NDBA與NDiBA(b)提取離子色譜圖Fig.2　Extracted ion chromatograms of NDPA, NDiPA (a) and NDBA, NDiBA (b) using different chromatographic columns

2.2.2梯度洗脫程序的優(yōu)化由于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑為甲醇-水溶液，為使流動相、標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品基體兼容，選擇甲醇-水溶液作為流動相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：甲醇比例低于90%時(shí)，極性最弱的NDiNA無法在20 min內(nèi)洗脫；提高甲醇比例至100%時(shí)，NDiNA可在14 min左右洗脫，但由于此時(shí)流動相的洗脫能力最強(qiáng)，在相同流速下，同分異構(gòu)體NDBA和NDiBA的分離度變差，不能實(shí)現(xiàn)基線分離；當(dāng)降低甲醇比例至98%時(shí)，既可保證NDiNA在14 min左右洗脫，也可使NDBA和NDiBA基線分離，因此將甲醇的最終比例定為98%。同時(shí)，為了使極性較強(qiáng)的NDELA、NDMA、NMOR和NPYR得到窄而尖的色譜峰，流動相的起始比例應(yīng)與標(biāo)液溶劑的組分接近。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)甲醇的起始比例為40%時(shí)，色譜峰出現(xiàn)了嚴(yán)重的前伸，峰寬變大、靈敏度顯著降低。為避免這4種分析物在死時(shí)間內(nèi)被洗脫，強(qiáng)洗脫溶劑的起始比例不應(yīng)過高，因此選擇10%作為甲醇的起始比例。當(dāng)進(jìn)一步降低甲醇比例至5%時(shí)，也可得到窄而尖的色譜峰，但梯度陡度增大，分離度下降，不利于同分異構(gòu)體NDBA和NDiBA的分離。因此，將甲醇的起始比例定為10%。根據(jù)色譜理論，梯度洗脫時(shí)間tG可按式(2)計(jì)算[17]：

(2)

(3)

式中，VD為液相色譜儀的柱前延遲體積，F(xiàn)為流速。本實(shí)驗(yàn)所使用儀器的柱前延遲體積約為800 μL，因此，延遲時(shí)間約為2.67 min，說明NDiNA出峰時(shí)仍在進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫程序優(yōu)化后，得到的提取離子色譜圖和總離子流色譜圖分別示于圖3和圖4。

圖3　色譜條件優(yōu)化后，14種N-亞硝胺的提取離子色譜圖(Q過程)Fig.3　Extracted ion chromatogram (Q transitions) of 14 N-nitrosamines after optimizd chromatographic conditions

注：1.NDELA;2.NDMA;3.NMOR;4.NPYR;5.NDEA;6.NPIP;7.NDiPA;8.NMPhA;9.NDPA;10.NEPhA;11.NDiBAh;12.NDBA;13.NDBzA;14.NDiNA圖4　色譜條件優(yōu)化后，14種N-亞硝胺的總離子流色譜圖Fig.4　Total ion chromatogram of 14 N-nitrosamines with optimizd chromatographic conditions

2.2.3甲酸濃度的優(yōu)化Herrmann等[11]指出，由于N-亞硝胺被電離時(shí)主要形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，因此降低了流動相的pH值，有利于提高流動相的質(zhì)子化程度，促進(jìn)質(zhì)子交換過程，在離子源中形成更多的[M+H]+，從而提高目標(biāo)分析物的響應(yīng)。另據(jù)文獻(xiàn)[10,18-22]報(bào)道，在水和(或)甲醇中加入甲酸、乙酸、甲酸銨或乙酸銨都可以達(dá)到降低流動相pH的目的，但使用甲酸時(shí)的干擾更低，故本研究選擇甲酸作為流動相改性劑。為找到最佳的甲酸濃度，分別配制了0%、0.005%、0.01%、0.015%、0.020%甲酸-水溶液和甲酸-甲醇溶液，將它們分別作為流動相分析1 μg/LN-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每次分析連續(xù)進(jìn)樣10次，計(jì)算峰面積的平均值，并用14種N-亞硝胺的峰面積對甲酸濃度作圖，結(jié)果示于圖5。

圖5　14種N-亞硝胺峰面積與甲酸濃度的關(guān)系Fig.5　Relationship of peak area and formic acid concentration of 14 N-nitrosamines

從圖5可見，14種N-亞硝胺響應(yīng)最高時(shí)對應(yīng)的甲酸濃度集中在0.005%～0.01%，當(dāng)甲酸濃度大于0.01%時(shí)，響應(yīng)有所下降。對于極性較弱的化合物NPIP、NDPA、NDiPA、NMPhA和NDBzA，當(dāng)甲酸濃度為0.02%時(shí)，響應(yīng)顯著降低，甚至低于甲酸濃度為0時(shí)的響應(yīng)，其他目標(biāo)物的響應(yīng)也有所下降，表明此時(shí)目標(biāo)物的電離受甲酸電離的抑制，[M+H]+氣相離子數(shù)量顯著減少。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，甲酸濃度為0.02%時(shí)，儀器精密度也有所下降，連續(xù)進(jìn)樣時(shí)峰面積的RSD值增大。因此，最終選擇0.01%甲酸作為流動相。

2.3線性方程和檢出限

實(shí)驗(yàn)考察了14種目標(biāo)物在0.2～100 μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系，結(jié)果表明，它們的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 5。如果將濃度范圍擴(kuò)展至0.2～200 μg/L，多數(shù)N-亞硝胺的線性關(guān)系變差，R2≤0.99。對0.1 μg/LN-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，通過計(jì)算信噪比得到14種目標(biāo)分析物的方法檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，結(jié)果列于表5。

2.4方法的回收率與精密度

對陰性氣球樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測試，使其添加水平分別為5、50、500 μg/kg，對應(yīng)的遷移液中目標(biāo)物濃度分別為0.5、5、50 μg/L。按2.2和2.3節(jié)優(yōu)化的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的回收率和精密度結(jié)果列于表6。可見，3個不同加標(biāo)水平的回收率分別為88.0%～122%、89.0%～106%、91.0%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%～13.9%、1.9%～9.2%、1.1%～6.6%。

2.5實(shí)際樣品的分析

對104個批次的橡膠和硅膠奶嘴、氣球及其他橡膠制品進(jìn)行抽查，陽性率為7.4%，其中硅膠奶嘴因避免了N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)的引入，陽性率為0%，風(fēng)險(xiǎn)較低。但抽查的8個氣球樣品中有6個陽性樣品，陽性率高達(dá)75%，測試結(jié)果列于表7。表中的遷移量(mg/kg)是由遷移液測試值換算而來的，換算公式示于式(4)：

(4)

表5　14種N-亞硝胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限及定量限

表6　14種N-亞硝胺的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表7　氣球樣品中N-亞硝胺和可N-亞硝化物質(zhì)的遷移量

注：—表示低于方法檢出限

式中：m為樣品的質(zhì)量，kg；V為遷移液體積，mL；c0為遷移液測試值，mg/L。由于我國缺少對氣球中N-亞硝胺遷移量的明確規(guī)定，因此本研究參考?xì)W盟玩具安全指令2009/48/EC的規(guī)定，即橡膠氣球或橡膠玩具中的N-亞硝胺遷移量不得超過0.05 mg/kg，可N-亞硝化物質(zhì)的遷移量不得超過1 mg/kg。從表7可見，白色氣球A、B和黃色氣球A、B的N-亞硝胺遷移量，以及全部6個陽性樣品的可N-亞硝化物質(zhì)遷移量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了遷移限量。另外，在日常測試中發(fā)現(xiàn)，NDMA是檢出最多的N-亞硝胺，風(fēng)險(xiǎn)最高，而多數(shù)不合格氣球樣品在亞硝化后會檢出NMPhA。

3　結(jié)論

通過對樣品進(jìn)行遷移和亞硝化，以及質(zhì)譜、色譜條件和參數(shù)的優(yōu)化，建立了同時(shí)測定與口接觸玩具及兒童用品中14種N-亞硝胺及可N-亞硝化物質(zhì)的HPLC-APCI-MS/MS方法。該方法前處理簡單，可直接分析遷移溶液，無需濃縮或萃取，檢出限能夠滿足德國法規(guī)的要求，具有較好的回收率和精密度。同時(shí)，通過對大量實(shí)際樣品的分析，篩選出了高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品為氣球，其中的高風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)為NDMA和NMPhA。該方法可為我國制定相關(guān)玩具及兒童用品的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，以及加強(qiáng)進(jìn)出口玩具及兒童用品的出入境檢驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

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Determination of 14 Migrations ofN-Nitrosamines andN-Nitrosatable Substances in Toys and Children’s Products by HPLC-APCI-MS/MS

HUANG Li-na1, LI Han-ke2, YI Le-zhou1, PENG Feng2, LI Qiong2

(1.InspectionandQuarantineTechnologyCenter,GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,China)

N-nitrosamines, known as strong carcinogens, are extensively concerned in safety of consumer products, especially in safety of toys. In the mean time,N-nitrosatable substances, such as secondary amines, which can convert toN-nitrosamines under certain circumstances, is concerned as well. Consequently, there are many regulations and standards successively published to restrictN-nitrosamines andN-nitrosatable substances in many countries. Generally speaking, toys and children’s products that contact with mouth, such as balloons and rubber teats, are more likely to containN-nitrosamines andN-nitrosatable substances. In order to meet the analytical requirements of exit-entry inspection of international regulations concerning toys and children’s products, a method of high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-APCI-MS/MS) was developed to determine the migrations of 14N-nitrosamines andN-nitrosatable substances in toys and children’s products that contact with mouth. Samples were cut into pieces and then migrated in artificial saliva to simulate mouth contact. The migration solution was used for the determination ofN-nitrosamines andN-nitrosatable substances after nitrosation afterwards in the presence of nitrite contained in artificial saliva. The conditions and parameters of liquid chromatography and mass spectrometry were optimized, such as multiple reaction monitoring, source-dependent parameters, chromatographic columns selection, gradient elution program and formic acid concentration. The results show that the linear relationships are good for all 14N-nitrosamines in the range of 0.2-100 μg/L with the correlation coefficient greater than 0.999 5. Method detection limits are 0.32-1.0 μg/kg, and the recoveries of 14N-nitrosamines are 88.0%-122%, 89.0%-106%, 91.0%-109% at the spiked levels of 5, 50, 500 μg/kg, respectively. The relative standard deviations (n=5) are 3.0%-13.9%, 1.9%-6.2%, 1.1%-6.6%, respectively. 104 batches of exit-entry spot-check samples were inspected, and it was found that balloons were high risk samples. There are totally 8 batches of balloon samples among all the inspected samples, migrations ofN-nitrosamines in 4 batches of balloon samples and migrations ofN-nitrosatable substances in 6 batches of balloon samples exceed the limit migrations specified in EU Toy Safety Directive 2009/48/EC. The balloon samples have the highest risk, so we need to give extra concern in terms ofN-nitrosamines andN-nitrosatable substances.

toys; children’s products; contant with mouth; migration;N-nitrosamines;N-nitrosatable substances; high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-APCI-MS/MS)

2015-10-31;

2015-12-17

廣東省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(2014A040401066)資助

黃理納(1971—)，男(漢族)，湖南株洲人，研究員，從事玩具及兒童用品化學(xué)檢測研究。E-mail: huangln@iqtc.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0453-12

10.7538/zpxb.youxian.2016.0019

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-28；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.010.html