高住高練低訓(xùn)不同時(shí)程大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的變化

李潔王世超

1西北師范大學(xué)體育學(xué)院（甘肅蘭州730070）

2大理學(xué)院

高住高練低訓(xùn)不同時(shí)程大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的變化

李潔1王世超2

1西北師范大學(xué)體育學(xué)院（甘肅蘭州730070）

2大理學(xué)院

目的：探討高住高練低訓(xùn)（HiHiLo）習(xí)服過程中大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的動(dòng)態(tài)變化。方法：48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組：常氧對(duì)照組，HiHiLo 1、2、3、4、5周組，每組8只。HiHiLo的5組大鼠在低氧（模擬海拔2500m）環(huán)境和常氧環(huán)境中居住和訓(xùn)練相應(yīng)周數(shù)，常氧對(duì)照組在常氧環(huán)境中不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。各組大鼠在完成相應(yīng)的訓(xùn)練后處死，即刻取血液和骨骼肌樣本，分離血清，提取骨骼肌線粒體，測(cè)定血清肌酸激酶（CK）活性及骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體NADH-CoQ還原酶（復(fù)合體Ⅰ，CⅠ）、琥珀酸-CoQ還原酶（復(fù)合體Ⅱ，CⅡ）、CoQ-細(xì)胞色素C還原酶（復(fù)合體Ⅲ，CⅢ）和細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體Ⅳ，CⅣ）活性。結(jié)果：與常氧對(duì)照組相比，HiHiLo 1、2、3周組CK活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。HiHiLo 1周組CI～I(xiàn)V活性均顯著下降（P＜0.01），HiHiLo 2周組CI、CII、CIV活性均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），HiHiLo 3周組CI活性顯著提高（P＜0.05），HiHiLo 4周和5周組CI～I(xiàn)V活性均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：在進(jìn)行本研究訓(xùn)練方案HiHiLo過程中，骨骼肌需2周的適應(yīng)期，第3周基本適應(yīng)，第4～5周線粒體呼吸鏈功能可顯著提高，第5周訓(xùn)練效果最佳。

高住高練低訓(xùn)；不同時(shí)程；骨骼肌；線粒體；呼吸鏈

針對(duì)高住低訓(xùn)（living hightraininglow，HiLo）缺乏低氧環(huán)境運(yùn)動(dòng)刺激，有些研究者［1］提出高住高練低訓(xùn)法（livinghigh-exercise high-training low，HiHiLo），即運(yùn)動(dòng)員居住在人工低氧環(huán)境中，以常氧訓(xùn)練為主、低氧訓(xùn)練為輔的綜合模式低氧訓(xùn)練法［2］，是目前最新的低氧訓(xùn)練手段之一［3，4］。目前學(xué)者著力于研究低氧訓(xùn)練對(duì)血液運(yùn)氧系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)等方面的影響［5］。細(xì)胞和分子水平的習(xí)服具體反映在線粒體，并將這一水平的習(xí)服稱為線粒體習(xí)服［6］，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ是電子傳遞鏈的重要組成成分，其活性變化能直接或間接地反映線粒體呼吸功能的變化［7］。本研究應(yīng)用小型低壓氧艙，觀察HiHiLo不同訓(xùn)練周期，大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的動(dòng)態(tài)變化，探討骨骼肌線粒體低氧訓(xùn)練的習(xí)服規(guī)律。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康2月齡Wistar大鼠60只，體重130 g左右，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（甘）2005-0007。常規(guī)飼喂。

1.2低壓氧艙

通過降低環(huán)境大氣壓，自制低壓氧艙［8］，模擬海拔2500 m（海拔表，COMPENS，序列號(hào)：60830，德國(guó)）的低氣壓低氧（氧含量約為15.4%）環(huán)境。

1.3動(dòng)物分組

根據(jù)體重、低氧適應(yīng)和跑臺(tái)（DSPT-202型動(dòng)物跑臺(tái)，中國(guó)杭州錢江科工貿(mào)公司）運(yùn)動(dòng)適應(yīng)情況，淘汰體重過輕或過重、不適應(yīng)低氧環(huán)境和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠，保留48只大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將篩選出的48只大鼠隨機(jī)分為常氧對(duì)照組、HiHiLo 1、2、3、4、5周組，每組8只。

1.4訓(xùn)練方案［9，10］

HiHiLo 1、2、3、4、5周組大鼠每天暴露于低氧環(huán)境12 h、常氧環(huán)境12 h；在常氧環(huán)境中分別進(jìn)行持續(xù)相應(yīng)周數(shù)、每周6天（周一～六）、每天30 min、速度為25 m/ min、坡度為0度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；訓(xùn)練日隔天（周二、四、六）增加一次在低氧環(huán)境中每天30 min、速度為20 m/min、坡度為0度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。常氧對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，置艙外飼養(yǎng)。

1.5取材及線粒體制備

常氧對(duì)照組飼養(yǎng)1周取材，HiHiLo5組分別于各組訓(xùn)練周期結(jié)束后進(jìn)行取材。安靜狀態(tài)下斷頭處死大鼠，取血和股四頭肌。血樣以3000轉(zhuǎn)/min離心15 min，分離血清置-20℃低溫保存待用。股四頭肌在冷生理鹽水中除去脂肪等結(jié)締組織，濾紙吸干水份，用錫紙包裹置于液氮中冷凍，-20℃低溫保存待用。每周稱體重一次。

將低溫保存的骨骼肌樣本于0～4℃放置融化，YQ-3電動(dòng)勻漿器（江蘇金壇市儀表儀器廠）制備勻漿液后用UNIVERSAL 32R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)）差速離心法提取線粒體［11］。

1.6指標(biāo)測(cè)試方法

1.6.1血清肌酸激酶活性測(cè)定

按肌酸激酶檢測(cè)試劑盒（寧波瑞源生物科技有限公司產(chǎn)品）說明書，采用UVmini-1240島津紫外可見分光光度計(jì)（日本島津精密科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.6.2線粒體呼吸鏈酶活性測(cè)定

采用UVmini-1240島津紫外可見分光光度計(jì)（日本島津精密科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體NADH-CoQ還原酶（復(fù)合體Ⅰ，CⅠ）、琥珀酸-CoQ還原酶（復(fù)合體Ⅱ，CⅡ）、CoQ-細(xì)胞色素C還原酶（復(fù)合體Ⅲ，CⅢ）和細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體Ⅳ，CⅣ）的活性［12］。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2　結(jié)果

2.1大鼠血清肌酸激酶（CK）的活性

如表1所示，與常氧對(duì)照組相比，HiHiLo 1、2、3周組CK活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），HiHiLo 4、5周組無(wú)顯著變化（表1）。

表1　大鼠血清CK的活性（U/L）

2.2大鼠骨骼肌線粒體酶復(fù)合體的活性

如表2所示，與常氧對(duì)照組相比，HiHiLo 1周組CI～I(xiàn)V活性均顯著下降（P＜0.01）；HiHiLo 2周組CI（P＜0.05）、CII（P＜0.05）、CIV（P＜0.01）活性均顯著下降，CⅢ活性無(wú)顯著性變化；HiHiLo 3周組CI活性顯著提高（P＜0.05），CII～I(xiàn)V活性均無(wú)顯著性變化；HiHiLo 4周組CI～I(xiàn)V活性均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）；HiHiLo 5周組CI～I(xiàn)V活性均顯著提高（P＜0.01）。

3　討論

3.1HiHiLo對(duì)大鼠血清CK活性的影響

CK是機(jī)體ATP-CP系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵酶之一。正常情況下肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、功能正常，CK極少透出細(xì)胞膜，血清中CK活性很低。血清中CK活性的變化能反映肌細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)程度［13］。

本研究訓(xùn)練期間，第1和第2周CK活性顯著增高，第2周達(dá)到最高值，從第3周開始下降，第4和第5周逐漸下降已接近安靜狀態(tài)。CK活性由高到低為HiHiLo 2周＞HiHiLo 1周＞HiHiLo 3周＞HiHiLo4周＞HiHiLo 5周。這可能是在2500m高度髙住高練低訓(xùn)初期，運(yùn)動(dòng)時(shí)缺氧和氧自由基增加導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)遭到破壞、通透性增加，組織酶向血液中滲出增加，因而血清酶活性增高；隨著低氧訓(xùn)練進(jìn)程的發(fā)展，機(jī)體逐漸對(duì)缺氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練產(chǎn)生了適應(yīng)，肌肉組織和血液中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子大量生成［14］、血管增生［15］、攜氧能力增加、抗氧化酶活性增加、細(xì)胞膜穩(wěn)定性增強(qiáng)，使運(yùn)動(dòng)后組織的損傷程度下降，從而血清酶的活性降低，逐漸接近安靜水平。提示經(jīng)過2周訓(xùn)練，機(jī)體尚未適應(yīng)低氧訓(xùn)練，從第3周開始機(jī)體對(duì)低氧訓(xùn)練產(chǎn)生適應(yīng)，第4、5周已完全適應(yīng)。平原運(yùn)動(dòng)員初到高原訓(xùn)練時(shí)，由于受到高原缺氧影響，CK明顯上升［16］，在高住低練的初期，運(yùn)動(dòng)員血清CK活性明顯高于對(duì)照組，而高住低練4周后，血清酶活性則明顯低于對(duì)照組，并可持續(xù)到高住低練之后2周［17］。

機(jī)體對(duì)低氧訓(xùn)練存在適應(yīng)期，習(xí)服后能減少肌肉組織的損傷、增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而改善由于低氧訓(xùn)練引起的血清酶活性升高。

3.2HiHiLo對(duì)大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響

從本研究結(jié)果可看出，HiHiLo第1周結(jié)束時(shí)，骨骼肌CI～I(xiàn)V活性均顯著性下降，提示急性低氧運(yùn)動(dòng)可明顯影響骨骼肌線粒體呼吸功能，可能會(huì)給骨骼肌能量代謝造成障礙，從而影響骨骼肌的收縮與舒張功能。HiHiLo第2周結(jié)束時(shí)，大鼠骨骼肌CI～I(xiàn)V活性較第1周有所提高，CⅢ活性接近于常氧對(duì)照組，但CI、CII、CIV活性仍顯著低于對(duì)照組，說明CⅢ對(duì)HiHiLo的習(xí)服用時(shí)最短，而CI、CII、CIV還沒能適應(yīng)HiHiLo，骨骼肌的能量生成率和代謝水平仍舊較低。HiHiLo第3周結(jié)束時(shí)，大鼠骨骼肌CI～I(xiàn)V活性高于第2周，且CI活性顯著高于常氧對(duì)照組，CII～I(xiàn)V的活性與常氧對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說明大鼠經(jīng)過3周的HiHiLo，骨骼肌線粒體酶活性顯著增強(qiáng)，已經(jīng)基本達(dá)到甚至高于安靜組狀態(tài)，大鼠此時(shí)的骨骼肌代謝水平較高，線粒體習(xí)服過程已基本完成。HiHiLo第4周結(jié)束時(shí)，大鼠骨骼肌CI～I(xiàn)V活性均高于第3周，且顯著高于常氧對(duì)照組，說明大鼠已完成了對(duì)HiHiLo過程的習(xí)服，骨骼肌代謝水平及能量生成率將顯著升高。HiHiLo第5周結(jié)束時(shí)，大鼠骨骼肌CI～I(xiàn)V活性進(jìn)一步提高，均高于第4周。由此可見，機(jī)體進(jìn)行HiHiLo的過程中，骨骼肌線粒體呼吸鏈功能經(jīng)歷1～2周的適應(yīng)期，第3周基本適應(yīng)，達(dá)常氧水平，第4～5周線粒體呼吸鏈功能提高，第5周訓(xùn)練效果最佳。本研究小組前期研究表明，HiHiLo 5周骨骼肌線粒體抗自由基酶活性顯著增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化物含量顯著下降，呼吸鏈酶活性顯著提高（P＜0.01）［18］。該研究結(jié)果的機(jī)制可能為，低氧訓(xùn)練初期，自由基產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過氧化損傷，進(jìn)而引起呼吸鏈酶活性下降，隨著低氧訓(xùn)練的進(jìn)行，線粒體抗氧化能力不斷增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化損傷降低，呼吸鏈酶活性得到提高。本研究中血清CK活性的變化規(guī)律，可佐證過氧化損傷隨低氧訓(xùn)練的進(jìn)程有所下降。此外，隨著低氧訓(xùn)練進(jìn)程的發(fā)展，骨骼肌線粒體三羧酸循環(huán)增強(qiáng)，呼吸鏈酶催化底物（NADH和FADH2）增多，也會(huì)促進(jìn)呼吸鏈酶活性的提高，已有研究表明［19］，低氧訓(xùn)練3周能提高大鼠骨骼肌三羧酸循環(huán)限速酶——蘋果酸脫氫酶（MDH）的活性。另有研究表明，大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶活性對(duì)低氧訓(xùn)練的習(xí)服需要3周的時(shí)間［20］，線粒體呼吸鏈酶活性在低氧訓(xùn)練過程中存在習(xí)服過程，習(xí)服后酶活性有提高的潛力。

表2　骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的活性（μmol/min per mg protein）

低氧訓(xùn)練將影響機(jī)體組織線粒體的功能，線粒體呼吸鏈功能對(duì)低氧訓(xùn)練有習(xí)服期，習(xí)服過程需要3周時(shí)間。

4　總結(jié)

在進(jìn)行本研究訓(xùn)練方案HiHiLo過程中，骨骼肌需2周的適應(yīng)期，第3周基本適應(yīng)，第4～5周線粒體呼吸鏈功能可顯著提高，第5周訓(xùn)練效果最佳。

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Change in Mitochondrial Respiratory Chain Function in Skeletal Muscle of Rats during the HiHiLo

Li Jie1，Wang Shichao2
1 College of Physical Education，Northwest Normal University，Lanzhou，China 730070
2 Dali University，Yunnan，China 671003

Li Jie，Email：lijie2005ty@126.com

Objective To observe the change in mitochondrial respiratory chain function in skeletal muscle of rats during living in high altitude-exercise in high altitude-training in low altitude（HiHiLo）.Methods 48 healthy male Wistar rats were randomly and equally divided into normoxic control group（C），1-week HiHiLo group（1WH），2-week HiHiLo group（2WH），3-week HiHiLo group（3WH），4-week HiHiLo group（4WH），and 5-week HiHiLo group（5WH）.Except the group C，the rats in 1WH，2WH，3WH，4WH and 5WH lived and trained in hypoxic environment（simulated altitude of about 2500 m）and normoxic environment respectively for 1 week，2 weeks，3 weeks，4 weeks and 5 weeks.Rats in groups C and 1WH were scarified by the end of week 1，and in the other groups were scarified by the end of week 2，3，4 and 5 respectively.The blood and skeletal muscles were sampled immediately after the sacrifice.The activities of creatine kinase（CK），respiratory chain complex I（NADH-CoQ reductase，CI），complex II（succinate CoQ reductase，CII），complex III（CoQ-cytochrome C reductase，CIII），and complex IV（cytochrome oxidase，CIV）in serum or muscular mitochondria were determined.Results The activity of CK increased significantly in groups 1WH，2WH and 3WH as compared with that in group C（P＜0.05，P＜0.01）.As compared with the group C，the activities of CI，CII，CIII and CIV in group 1WH，the activities of CI，CII and CIV activities in group 2WH decreased significantly（P＜0.01，P＜0.05），the activity of CI in group 3WH increased significantly（P＜0.05），and the activities of CI，CII，CIII and CIV in groups 4WH and 5WH increased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion In this study the mitochondrial respiratory chain function in skeletal muscle improved significantly after 3 weeks of HiHiLo and reached its optimum at the 5th week of HiHiLo.

HiHiLo，duration，skeletal muscle，mitochondria，respiratory chain

2014.12.06

國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31060145）

李潔，Email：lijie2005ty@126.com