基于代謝組學研究橙黃決明素對高脂血癥大鼠的調(diào)脂作用

余 勝， 鄧 楠， 劉 文， 戴迎春， 張 惠

(1.湖南省人民醫(yī)院藥學部，湖南長沙 410005；2.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南長沙 410006)

高血脂癥是由于脂肪代謝或運轉(zhuǎn)異常使血漿一種或多種脂質(zhì)高于正常值而引起的疾病，為動脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素，常因危害重要器官而引起嚴重后果，如冠心病、腦血管意外等。目前臨床上廣泛應(yīng)用他汀類藥物來治療高血脂癥并預(yù)防心腦血管意外事件，療效較顯著。但長期或大劑量使用他汀類藥物可能會導(dǎo)致心臟橫紋肌溶解、肝臟組織細胞生物化學變化等嚴重不良反應(yīng)[1 - 3]。因此，研究和開發(fā)安全、有效的新型降血脂藥物十分重要。代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后發(fā)展起來的一門關(guān)于生物體內(nèi)源代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的學科[4]。近年來，代謝組學已被成功的應(yīng)用于高血脂癥的研究，為高血脂癥的診斷和治療提供了有效幫助[5 - 7]。

決明子作為一種常見的中藥材，長期臨床應(yīng)用表明其降脂作用明確，療效可靠，副作用少，但與其他傳統(tǒng)中藥一樣，存在著成分復(fù)雜、機理不十分清楚等缺點[8 - 10]。已有研究報道，橙黃決明素是決明子降脂作用的有效活性成分[11]。在前人研究的基礎(chǔ)上，本文運用代謝組學方法考察橙黃決明素對高脂血癥的逆轉(zhuǎn)程度及調(diào)控作用，為新型調(diào)脂藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman AU5821全自動生化分析儀(美國，貝克曼公司)；WH-2微型旋渦混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；TGL-16高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；GCMS-QP2010氣-質(zhì)聯(lián)用儀(日本，島津公司)；島津DB-5熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

膽固醇(北京樂博生物科技有限公司)；膽鹽、蛋黃粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)；甲硫氧嘧啶(天津市博迪化工有限公司)；橙黃決明素(四川維克奇生物科技有限公司)；2-異丙基蘋果酸(Sigma公司)?？偰懝檀?TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-c)測定試劑盒，均由北京九強生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實驗動物

SD雄性大鼠30只，體重180～220 g，購于斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號：SCXK(湘)2013-0004)，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院實驗動物中心動物實驗室。

1.3 高血脂癥大鼠造模及取樣

采用文獻中高脂飼料造模方法[12]，將大鼠隨機分成2組，正常對照組(10只)：普通飼料喂養(yǎng)；高血脂癥模型組(20只)：高脂飼料(蛋黃粉8%、豬油6%、膽固醇4%、膽酸鈉0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、基礎(chǔ)飼料81.3%)喂養(yǎng)。30 d后眼底靜脈叢取血檢測其生化指標，確認造模效果。造模過程中高血脂癥模型組死亡4只，將余下的16只平均隨機分成2組，分別為模型組和橙黃決明素組，于造模成功后，橙黃決明素組灌胃橙黃決明素3.6 mg/(kg·d)，正常組和模型組則給予等量安慰劑(羧甲基纖維素鈉)。治療30 d后眼底靜脈叢取血，12 000 r/min離心10 min(4 ℃)，取血漿于-20 ℃下保存，用于GC-MS檢測。

1.4 生化指標分析

取100 μL血漿樣本，利用Beckman AU5821全自動生化分析儀，分別逐次測出每個樣本的LDL-c、TG、TC、HDL-c值等參數(shù)，并獲取進行自動分析后的數(shù)據(jù)值。

1.5 樣品預(yù)處理與GC-MS分析

結(jié)合石書婷等[13]的研究進一步優(yōu)化樣品前處理方法。取100 μL血漿樣本置于1.5 mL離心管中，加入10 μL 2-異丙基蘋果酸/甲醇溶液(內(nèi)標，1 mg/mL)，渦旋15 s，再加入300 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋15 s，離心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上清液置于離心管，常溫下氮氣吹干，加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)，渦旋30 s后，70 ℃水浴肟化1 h，再加入100 μL硅烷化試劑N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，內(nèi)含1% TMCS)，渦旋10 s，70 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，取100 μL于微量進樣管中用于GC-MS進樣分析，進樣量1 μL。

GC-MS分析條件：進樣口溫度280 ℃，初始柱溫70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min速度升溫至300 ℃，保持3 min；接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；氦氣作為載氣，流速1 mL/min，分流比10∶1，全掃描35～850m/z；溶劑切除時間6.5 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

生化指標結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準偏差(mean±SD)表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用島津色譜工作站對GC-MS總離子流圖中各種代謝物的峰面積進行積分，利用NIST107和NIST05數(shù)據(jù)庫對血漿中的代謝物進行鑒定，以相對峰面積(與內(nèi)標峰的比值)表示代謝物的含量，得到GC-MS數(shù)據(jù)。各組灌胃給藥前后的代謝物譜數(shù)據(jù)利用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判別分析(PLS -DA)和隨機森林算法(RF)進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 生化指標分析

表1列出了造模前后生化指標值的比較關(guān)系。正常組在造模前后TC與LDL-c的變化不明顯(P>0.05)，而模型組在造模前后TC與LDL-c的變化體現(xiàn)了顯著性升高(P<0.01)，表明造模成功。

表1 大鼠造模前后血脂指標

2.2 GC-MS數(shù)據(jù)分析和生物標志物的鑒定

經(jīng)GC-MS法測定，大鼠血漿的總離子流色譜圖(TIC)，如圖1所示。結(jié)果表明，大鼠血漿中有47種內(nèi)源性代謝物(去除內(nèi)標，同時合并重復(fù)出現(xiàn)的峰)，結(jié)果見表2。

2.3 多元統(tǒng)計分析

表2 GC-MS檢測到的大鼠血漿內(nèi)源性代謝物

* Identified by standard substances,**Internal standard.

2.3.2PLS-DA結(jié)果相對于PCA，PLS-DA以預(yù)測均方根誤差為回歸目標，能使得預(yù)測結(jié)果的均方根誤差更小，更具可靠性[14]。運用SIMCA-P 11.0軟件對大鼠血漿內(nèi)源性代謝物進行PLS-DA分析，結(jié)果如圖3所示?？梢钥吹秸＝M與模型組在空間中得到了完全分離，橙黃決明素組向正常組靠近，證明橙黃決明素具有較佳的調(diào)脂效果。由于PLS-DA易產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象[15]，為消除其影響，本工作采用隨機森林分析法作進一步研究。

2.3.3RF結(jié)果RF是一種基于決策樹的組合分類器，具有不易過擬合，預(yù)測較準確等優(yōu)點，同時對變量間的非線性關(guān)系和交互作用可更有效識別[16]。運用MATLAB軟件，并設(shè)定參數(shù)為(mtree=1 000；ntree=1 000)對大鼠血漿內(nèi)源性代謝物進行RF分析，得到投影圖和回歸系數(shù)圖(圖4)。從圖4(a)可以看出，模型組與正常組完全分離，橙黃決明素組遠離模型組，向正常組靠近，表明橙黃決明素調(diào)脂效果明顯。從圖4(b)得到造模前后大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物變化最顯著的10種，即為潛在的生物標志物：丙氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、富馬酸、絲氨酸、1,5-脫水山梨醇、亞油酸、硬脂酸和膽固醇。高脂飼料造模的過程中，大鼠血漿中甘氨酸、絲氨酸、硬脂酸及膽固醇含量上升，丙氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、富馬酸、1,5-脫水山梨醇及亞油酸則下降，與已有報道基本符合[17]；再比較高血脂癥模型組與橙黃決明素灌胃治療30 d后大鼠血漿內(nèi)源性代謝物的變化，得到10種變化最大的代謝物：丙氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、尿素、異亮氨酸、富馬酸、絲氨酸、苯丙氨酸、硬脂酸和膽固醇，與造模前后得到的高血脂癥生物標志物相比，橙黃決明素治療后，大部分代謝物變化得到回調(diào)，另外增加了對尿素和苯丙氨酸的影響。說明橙黃決明素主要通過調(diào)整體內(nèi)部分氨基酸及游離脂肪酸而起到調(diào)脂作用。

3 結(jié)論

本研究利用基于GC-MS的代謝組學研究了橙黃決明素治療高脂血癥大鼠血漿中代謝物的變化，多元統(tǒng)計分析證實了橙黃決明素可以較好地調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平。證明了橙黃決明素作用于氨基酸及脂肪酸的代謝通路，能夠達到較好的調(diào)脂作用。