庫(kù)爾特原理及其應(yīng)用

楊文志，王曉東，李 橙

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庫(kù)爾特原理及其應(yīng)用

楊文志，王曉東，李 橙

（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)材料科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院，北京 100049）

在研究血液細(xì)胞的自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)時(shí)，美國(guó)人華萊士?H?庫(kù)爾特于20世紀(jì)50年代提出了庫(kù)爾特原理，也被稱(chēng)為電敏感區(qū)法，即利用微顆粒隨導(dǎo)電液體通過(guò)電敏感區(qū)時(shí)形成的脈沖信號(hào)來(lái)測(cè)量其尺寸和數(shù)量（或頻度）的一種電學(xué)方法，其后逐漸發(fā)展成為血液自動(dòng)檢測(cè)的一項(xiàng)成熟技術(shù)，并被美國(guó)衛(wèi)生部門(mén)定為該行業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本文介紹了庫(kù)爾特原理及其發(fā)展歷程，詳述了該原理在細(xì)胞、基因和冶金等領(lǐng)域里的應(yīng)用。庫(kù)爾特原理的應(yīng)用已不僅局限于細(xì)胞計(jì)數(shù)等血液學(xué)方面，在空氣與水污染、食品、燃料、潤(rùn)滑、涂料、海洋生物、造紙、制藥、石油化工、攝影、染料、疫苗等超過(guò)四十個(gè)領(lǐng)域里同樣應(yīng)用廣泛。

庫(kù)爾特原理、顆粒、電阻、細(xì)胞、基因、冶金、化工

引言

20世紀(jì)50年代，華萊士?H?庫(kù)爾特和他的兄弟小約瑟夫?R?庫(kù)爾特在研究血液細(xì)胞自動(dòng)化檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)并提出了庫(kù)爾特原理，此后該原理逐漸發(fā)展成為血液自動(dòng)檢測(cè)的一項(xiàng)成熟技術(shù)，并被美國(guó)衛(wèi)生部門(mén)定為該行業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。其后該原理被廣泛借鑒，在短短幾十年的時(shí)間內(nèi)，已逐漸被應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器如今在為眾多行業(yè)提供世界先進(jìn)的顆粒特性表征技術(shù)，僅以美國(guó)為例，到20世紀(jì)80年代已有NASA等單位將基于該技術(shù)的激光粒分析儀等儀器使用在火星登陸探測(cè)等重要領(lǐng)域[1]。如今，庫(kù)爾特原理已經(jīng)給數(shù)千種來(lái)自工業(yè)、生物學(xué)等不同領(lǐng)域的顆粒材料進(jìn)行了相關(guān)的表征測(cè)試，有超過(guò)六千份文獻(xiàn)參考資料的內(nèi)容使用了庫(kù)爾特原理[2]，相關(guān)的專(zhuān)利有數(shù)百種，同時(shí)有多篇采用庫(kù)爾特原理的高水平研究論文被發(fā)表在Nature等學(xué)術(shù)界頂尖期刊。庫(kù)爾特原理的應(yīng)用從最初的血液細(xì)胞檢測(cè)到如今生物學(xué)研究領(lǐng)域最常用的使用儀器，從血液學(xué)領(lǐng)域最成功的儀器再到陶瓷、冶金、制藥、化工甚至航天等等各行業(yè)的應(yīng)用，范圍廣闊，發(fā)展迅猛。本文通過(guò)介紹庫(kù)爾特原理在幾個(gè)典型行業(yè)的經(jīng)典運(yùn)用及相關(guān)的發(fā)展歷程，揭示了知識(shí)及理論在不同專(zhuān)業(yè)、行業(yè)內(nèi)跨學(xué)科借鑒的重要性。

1 庫(kù)爾特測(cè)量原理及其發(fā)展歷程

庫(kù)爾特原理被提出之前，對(duì)于血液中紅細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)仍采用原始的人工計(jì)數(shù)的方式，技術(shù)人員通常要采用顯微鏡來(lái)觀察采集到的血液樣本，然后計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)容器內(nèi)所有紅血球的數(shù)目[3]。該方法效率極低，一名技術(shù)人員處理一份試樣所耗費(fèi)的時(shí)間通常超過(guò)30分鐘，同時(shí)該方法可重復(fù)性很差，不同技術(shù)人員的計(jì)數(shù)結(jié)果往往差別較大。這使得更精確的自動(dòng)化血液細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展成為必要。在庫(kù)爾特兄弟之前，Moldavan提出使用光學(xué)方法來(lái)進(jìn)行血細(xì)胞的計(jì)數(shù)，即使用一條光束，統(tǒng)計(jì)經(jīng)過(guò)光束的細(xì)胞數(shù)量[3]。受到這種思路的啟發(fā)，庫(kù)爾特兄弟在探索相應(yīng)的光學(xué)方法的過(guò)程中無(wú)意間發(fā)現(xiàn)了一種基于電脈沖的方法，隨后便提出了庫(kù)爾特原理并將其應(yīng)用到了實(shí)踐當(dāng)中，最終實(shí)現(xiàn)了血液細(xì)胞的自動(dòng)化檢測(cè)工作。

基于庫(kù)爾特原理的技術(shù)方法亦被稱(chēng)為電阻法、電脈沖法或電感應(yīng)技術(shù)，主要利用微顆粒隨導(dǎo)電液體通過(guò)電敏感區(qū)時(shí)形成的脈沖信號(hào)來(lái)測(cè)量顆粒尺寸和數(shù)量（或頻度）。1956年華萊士在其個(gè)人論文中正式發(fā)布了庫(kù)爾特原理的內(nèi)容。圖1為基于該原理的檢測(cè)方法示意圖。如圖所示，在絕緣試管的側(cè)壁開(kāi)一個(gè)小孔，將一對(duì)電極分別放在試管內(nèi)外并通直流電，這樣在小孔附近就形成了電敏感區(qū)。如果導(dǎo)電液中存在顆粒，當(dāng)顆粒通過(guò)小孔時(shí)，由于顆粒和導(dǎo)電液之間的電導(dǎo)率差異，會(huì)導(dǎo)致電極之間的電壓發(fā)生一定變化，形成脈沖信號(hào)，該信號(hào)能反映出顆粒的大小和數(shù)量[4]。由麥克斯韋方程組可知，當(dāng)雜質(zhì)顆粒經(jīng)過(guò)小孔時(shí)，電壓的變化可以表示為[5-7]：

為顆粒夾雜物的名義尺寸；

為小孔直徑或電敏感區(qū)特征尺寸。

雖然庫(kù)爾特原理及基于此原理的檢測(cè)設(shè)備如今已被廣泛應(yīng)用于很多行業(yè)，但其發(fā)展并不是一帆風(fēng)順的，主要經(jīng)歷了以下三個(gè)發(fā)展階段[3]。

第一個(gè)階段為初創(chuàng)階段。庫(kù)爾特兄弟通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該原理的可行性，并獲得了相應(yīng)的專(zhuān)利。最初，庫(kù)爾特兄弟采用的是光學(xué)計(jì)數(shù)的思路，著手于光學(xué)方法的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，不斷對(duì)光束進(jìn)行調(diào)節(jié)，但并沒(méi)有獲得很好的結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，他們無(wú)意間發(fā)現(xiàn)了電脈沖法，通過(guò)調(diào)節(jié)電流獲得了初步的解決方案，盡管此時(shí)他們還不知道血細(xì)胞是電的絕緣體[3]。和很多偉大的發(fā)明一樣，初創(chuàng)時(shí)期研究條件都非常艱苦。由于經(jīng)費(fèi)不足，他們只能在位于地下室的實(shí)驗(yàn)室工作[3]。最初的實(shí)驗(yàn)條件非常簡(jiǎn)陋，開(kāi)始的時(shí)候他們使用的是煙盒上取下來(lái)的金屬鋁箔，再用加熱的針在鋁箔上面刺一個(gè)小孔，然后通過(guò)橡膠圈把玻璃紙固定在玻璃管的末端[3]，將電極置于小孔兩側(cè)并通電，制作了簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)裝置原型。當(dāng)血細(xì)胞通過(guò)小孔時(shí)，通過(guò)檢測(cè)電極兩端的電壓差，庫(kù)爾特兄弟發(fā)現(xiàn)該電壓脈沖信號(hào)是光電方法的十倍。經(jīng)過(guò)反復(fù)的嘗試，庫(kù)爾特兄弟發(fā)現(xiàn)可以采用電壓脈沖來(lái)對(duì)流經(jīng)小孔的懸浮液中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)促使他們開(kāi)始申請(qǐng)專(zhuān)利。值得一提的是，此時(shí)，數(shù)位專(zhuān)利審查人員都認(rèn)為“你不能為小孔申請(qǐng)專(zhuān)利[3]”。庫(kù)爾特兄弟沒(méi)有放棄，他們通過(guò)提供一些具體的應(yīng)用例子而非僅提供原理，終于于1953年被破例授予了具有開(kāi)創(chuàng)性的庫(kù)爾特原理的專(zhuān)利權(quán)[3]。在此之后，他們將研究重點(diǎn)放在了如何使計(jì)數(shù)自動(dòng)化變得可行。通過(guò)使用原貝特曼儀器公司提供的脈沖計(jì)數(shù)器和自己發(fā)明的水銀壓力計(jì)，庫(kù)爾特兄弟證明了血液測(cè)試自動(dòng)化工作的可行性并搭建出了原型儀器。經(jīng)過(guò)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的評(píng)估，這些儀器在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)上的準(zhǔn)確性和方便性得到了充分的認(rèn)可[3]。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[7]

第二個(gè)階段為技術(shù)研發(fā)階段。庫(kù)爾特兄弟在此階段成立了公司，實(shí)現(xiàn)了庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器的商業(yè)化。對(duì)于庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器而言，小孔的孔徑和穩(wěn)定性至關(guān)重要。為了解決在試管壁上開(kāi)孔的可重復(fù)性差和穩(wěn)定性低的缺點(diǎn)，庫(kù)爾特兄弟與瑞士珠寶公司和美國(guó)Del Mar Scientific公司合作，在寶石上制備出了堅(jiān)固的小孔，然后將寶石鑲嵌到試管壁上，為導(dǎo)電液體和血細(xì)胞提供了持久耐用的通道。之后他們創(chuàng)立了庫(kù)爾特電子公司，組裝出了A型庫(kù)爾特測(cè)量?jī)x進(jìn)行銷(xiāo)售和推廣，并在白細(xì)胞計(jì)數(shù)上取得了良好的成就。后來(lái)，公司通過(guò)使用電流源代替原來(lái)的電壓源，使用雙閾值電流靈敏放大器代替了原來(lái)的單閾值電壓放大器，使得測(cè)量?jī)x的檢測(cè)更為精確，逐漸衍生出了B型和C型測(cè)量?jī)x[3]。到20世紀(jì)60年代，庫(kù)爾特測(cè)量?jī)x已在血液細(xì)胞的自動(dòng)化計(jì)數(shù)和體積測(cè)量上有了良好的表現(xiàn)，并開(kāi)始逐漸被應(yīng)用于微生物學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域的粒度分析方面。

（左邊方形控制臺(tái)表盤(pán)從左到右顯示為：機(jī)械計(jì)數(shù)器，三個(gè)十進(jìn)制計(jì)數(shù)器，以及示波鏡顯示管。）

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[3]

第三個(gè)階段為庫(kù)爾特測(cè)量?jī)x的完善、成熟階段。在這一階段，儀器一些功能上的缺點(diǎn)被克服，公司也不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)出了自動(dòng)化程度越來(lái)越高的測(cè)量?jī)x。美國(guó)國(guó)立研究院（NIH）發(fā)現(xiàn)，在測(cè)量過(guò)程中，感測(cè)小孔周?chē)募?xì)胞和電場(chǎng)的相互作用會(huì)給體積測(cè)定帶來(lái)一定的偏差，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了粒子重合、粒度分布不對(duì)稱(chēng)、感測(cè)小孔長(zhǎng)度對(duì)結(jié)果有影響等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，庫(kù)爾特兄弟成立的公司和其他研究單位進(jìn)行了大量的研究，通過(guò)改變小孔長(zhǎng)度、改變脈沖抽樣方式、發(fā)明新的細(xì)胞分類(lèi)器、采用最新的晶體管等手段，逐漸改進(jìn)測(cè)量?jī)x，使得儀器性能有了很大的提升，推進(jìn)了庫(kù)爾特原理的應(yīng)用與發(fā)展。1968年，第一臺(tái)自動(dòng)化血液分析儀被發(fā)明出來(lái)，1972年體積分析儀被發(fā)明，同時(shí)，出現(xiàn)了工業(yè)上用的TA系列計(jì)數(shù)器。之后不久，該類(lèi)型的儀器開(kāi)始采用更為先進(jìn)的微處理器[3]。在庫(kù)爾特兄弟及其他研究者的努力下，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多基于庫(kù)爾特原理的經(jīng)典產(chǎn)品。比如，2000年左右推出Multisizer系列儀器已成為迄今為止功能最全的顆粒計(jì)數(shù)及粒度分析儀，具備極高的分辨率，在工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。

2 庫(kù)爾特原理的應(yīng)用

基于庫(kù)爾特原理的儀器設(shè)備發(fā)展快速而廣泛。目前，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一系列的產(chǎn)品以滿(mǎn)足各個(gè)行業(yè)的需要，產(chǎn)品已被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)粉體、磨料、熒光粉、碳粉、油田注水、黏土、針劑、醫(yī)用乳劑、水處理、過(guò)濾、細(xì)胞、浮游生物、陶瓷、冶金、制藥、化工、食品添加劑、酵母、高分子聚合體等行業(yè)的顆粒檢測(cè)[1]。例如，為滿(mǎn)足航空航天和國(guó)防工業(yè)的要求而設(shè)計(jì)的MET ONE和HIAC顆粒計(jì)數(shù)器，能確保用于飛機(jī)生產(chǎn)的潔凈室環(huán)境得到優(yōu)化；而針對(duì)空氣檢測(cè)的便攜式空氣顆粒技術(shù)器，最小可檢測(cè)0.3微米尺寸的顆粒[1]。下文著重介紹庫(kù)爾特原理的幾種典型運(yùn)用，通過(guò)具體的實(shí)例闡述其發(fā)展過(guò)程，亦借以凸顯不同行業(yè)之間知識(shí)借鑒的重要性。

2.1 在細(xì)胞檢測(cè)方面的應(yīng)用

庫(kù)爾特原理應(yīng)用之初是為了實(shí)現(xiàn)血液細(xì)胞計(jì)數(shù)的自動(dòng)化。迄今為止，基于該原理的計(jì)數(shù)技術(shù)已經(jīng)被醫(yī)學(xué)行業(yè)認(rèn)為是細(xì)胞計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，被廣泛應(yīng)用于白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的計(jì)數(shù)工作，以及網(wǎng)織紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)分析。如今，除了基礎(chǔ)的細(xì)胞生物學(xué)研究以外，該原理的應(yīng)用范圍已得到很大的延伸，從生理學(xué)檢測(cè)到臨床診斷再到科學(xué)研究，該類(lèi)技術(shù)在細(xì)胞檢測(cè)方面的高效性已經(jīng)為生物醫(yī)學(xué)相關(guān)行業(yè)帶來(lái)了全新的、有進(jìn)展性的益處[8]，該類(lèi)儀器也已被業(yè)界評(píng)為血液學(xué)領(lǐng)域使用最成功的儀器。

細(xì)胞數(shù)量和體積的檢測(cè)對(duì)于臨床體外診斷有著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果可以幫助醫(yī)務(wù)工作者徹底診斷疾病[8]。在正常情況下，血液細(xì)胞的體積變化很小，因此，細(xì)胞體積發(fā)生改變就提示了機(jī)體的調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)了紊亂。由于庫(kù)爾特原理在細(xì)胞計(jì)數(shù)上應(yīng)用的準(zhǔn)確性和高效性，它已被頻繁地應(yīng)用于相關(guān)的研究中。例如，對(duì)于鐮狀細(xì)胞性貧血，細(xì)胞外環(huán)境的缺氧狀態(tài)會(huì)刺激離子通道，間接導(dǎo)致嚴(yán)重的紅細(xì)胞皺縮。這種最初的皺縮會(huì)引起一種異常血紅蛋白的聚合，從而讓細(xì)胞呈鐮刀狀。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的體積變化，庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器能幫助確定鐮狀細(xì)胞性貧血的存在[8]。除此之外，庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器也可以幫助診斷由細(xì)胞內(nèi)部因素導(dǎo)致的疾病，比如廣為人知的有絲分裂。由于在有絲分裂期間細(xì)胞會(huì)發(fā)生膨脹，通過(guò)庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化能刺激細(xì)胞從有絲分裂中期發(fā)展到后期。此外該測(cè)量原理另一個(gè)同樣重要的貢獻(xiàn)是采用細(xì)胞體積測(cè)量來(lái)討論一些特殊的疾病，幫助我們了解疾病的發(fā)病機(jī)制，例如糖尿病、腦損傷和不孕癥等[8]。

如上所述，庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器最重要的表現(xiàn)是通過(guò)對(duì)紅細(xì)胞的數(shù)量和體積的檢測(cè)，在臨床上幫助醫(yī)生檢測(cè)貧血、白血病前期、鐵缺乏等與血液相關(guān)的疾病。庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器工程上的靈活性設(shè)計(jì)保障了其高效性，降低了檢測(cè)成本。隨著技術(shù)的進(jìn)步，更多的分析條件被加入到庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器當(dāng)中，如最新的庫(kù)爾特血液分析儀中，通過(guò)專(zhuān)有試劑與射頻測(cè)量和光散射相結(jié)合可診斷如嗜紅細(xì)胞增多癥、粒細(xì)胞缺乏、原發(fā)性血小板增多癥等更多類(lèi)型的疾病[8]。

庫(kù)爾特原理是臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究的有效理論工具。圖3展示了貝克曼庫(kù)爾特公司最新型號(hào)的Multisizer 4產(chǎn)品，該儀器結(jié)合了多種創(chuàng)新技術(shù)，是迄今為止分辨率最高、功能最全的顆粒計(jì)數(shù)器，當(dāng)前已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。除了測(cè)量細(xì)胞的數(shù)量和體積，該儀器還可以分析顆粒的濃度和絕對(duì)體積，甚至能提供實(shí)時(shí)的跟蹤監(jiān)測(cè)分析。通過(guò)更換帶有不同孔徑的檢測(cè)試管，儀器的分析范圍從0.4 μm到1200 μm，可以幫助我們測(cè)量小到細(xì)菌或大到絮凝狀酵母之類(lèi)的微生物。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[2]

2.2 在DNA檢測(cè)方面的應(yīng)用

DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)于人類(lèi)的發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義，該技術(shù)的發(fā)展不僅對(duì)于生物學(xué)的發(fā)展具有巨大的推動(dòng)力，而且在促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展方面具有很大的潛力?；蚣夹g(shù)的進(jìn)步有利于人類(lèi)了解甚至攻克某些目前難以治愈的頑疾，如長(zhǎng)期危害人類(lèi)的癌癥等。準(zhǔn)確高效的測(cè)序方式一直是基因工程的重要目標(biāo)之一。在以往的科學(xué)研究中，主要測(cè)序方式包括Sanger法、化學(xué)降解等，這些方法檢測(cè)效率較低而成本很高。后來(lái)出現(xiàn)的高通量測(cè)序法，如焦磷酸測(cè)序法和可逆性鏈終止法等，可以一邊合成一邊測(cè)序，單次檢測(cè)量很大，但儀器非常昂貴，耗用時(shí)間長(zhǎng)[9, 10]。

由于基因工程的研究對(duì)象大多在分子水平甚至更小，DNA分子和蛋白質(zhì)分子大小一般在納米量級(jí)，而傳統(tǒng)的庫(kù)爾特技術(shù)所檢測(cè)的血細(xì)胞直徑大小一般在幾微米左右，兩者研究對(duì)象的體積存在著極大的差別。然而，有研究者巧妙借鑒了本來(lái)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的庫(kù)爾特原理，并成功將其應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。1999年，哈佛大學(xué)的Daniel Branton等[11]和德克薩斯A&M大學(xué)Hagan Bayley實(shí)驗(yàn)室[12]在Nature同期刊登了將庫(kù)爾特原理應(yīng)用于基因工程的文章，開(kāi)創(chuàng)了第三代DNA測(cè)序方法的先河。

對(duì)于許多未來(lái)的技術(shù)如電子、化工和生物等科學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展而言，對(duì)尺度在10–8m到10–9m的微觀物質(zhì)的檢測(cè)和操作至關(guān)重要[13-14]。在以前的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，科研工作者大多使用化學(xué)等手段，通過(guò)放大微觀相互作用的結(jié)果來(lái)間接觀測(cè)微觀尺度的事件。而B(niǎo)ayley實(shí)驗(yàn)室則將庫(kù)爾特原理應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域，設(shè)計(jì)出了觀測(cè)分子事件的新方法。他們使用絕緣薄膜來(lái)隔離離子液體，在薄膜上加工出原子大小的小孔，使用高精度的電子元器件以放大離子液體中的電流，通過(guò)檢測(cè)電流的變化，可以檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量低至100的有機(jī)分子[12]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員使用數(shù)個(gè)α-溶血素分子在磷脂雙分子層薄膜上形成分子通道，其中磷脂雙分子層薄膜的厚度為50埃米（埃米為十分之一納米），分子通道的直徑為15埃米[12]。由于磷脂雙分子層薄膜具有絕緣性，它將鹽溶液分為兩部分，溶液中通入直流電流，電流極小，在微微安培級(jí)別(10–12A)，通過(guò)高精度的半導(dǎo)體元件仍可以在室溫條件下檢測(cè)出該電流的存在[12]。在Bayley實(shí)驗(yàn)室工作的基礎(chǔ)上，哈佛大學(xué)的研究者通過(guò)使用一種β-環(huán)糊精的有機(jī)分子融入由α-溶血素分子組成的分子通道，通過(guò)減小小孔的孔徑來(lái)部分阻塞離子液體的通過(guò)，達(dá)到了增加該納米孔對(duì)特定有機(jī)分子的靈敏度[11]。經(jīng)過(guò)研究人員共同的努力，該方法最終成功地檢測(cè)出通過(guò)納米孔的DNA分子、RNA分子和蛋白質(zhì)分子，開(kāi)啟了將生物膜上的通道轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米孔的研究。

然而，通過(guò)生物化學(xué)方法制作的納米孔使用壽命短，耐溫性較差。隨著納米技術(shù)和相應(yīng)的加工技術(shù)的發(fā)展，采用微納米加工的手段制備納米孔已成為可能。與生物方法制備的納米孔相比，微納加工得到的納米孔不僅更堅(jiān)固，可重復(fù)性高，而且孔徑和薄膜的厚度可控性更好[15]，成為近年來(lái)發(fā)展的熱門(mén)趨勢(shì)。2001年，哈佛大學(xué)Branton實(shí)驗(yàn)室采用自制的反饋控制系統(tǒng)，首次實(shí)現(xiàn)了利用離子束刻蝕方法在Si3N4薄膜上加工出單個(gè)固態(tài)納米孔，并將其成功應(yīng)用于DNA分子的檢測(cè)[13]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究者先在500nm厚的薄膜上制備出100nm的小孔。當(dāng)數(shù)千電子伏特的高能量氬離子束沖擊物體表面時(shí)，會(huì)使表面原子脫離出去，慢慢地控制離子束逐步移除平坦的上表面，在自制的控制系統(tǒng)的及時(shí)反饋下，最終在真空中制備出了小至1.8nm的納米孔。在小孔制備完成以后，研究人員以5納米的小孔進(jìn)行了雙鏈DNA分子的檢測(cè)試驗(yàn)，薄膜將無(wú)機(jī)鹽溶液分為兩個(gè)腔體，兩根電極分別置于腔體中，施加電壓120毫伏，最終通過(guò)檢測(cè)液體中電流的變化成功地檢測(cè)出了通過(guò)小孔的DNA分子。

此后，各種各樣的微納技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)以進(jìn)行納米孔的加工[10]。如使用電子束鉆刻制備納米孔：波士頓大學(xué)M. J. kim等人[16]通過(guò)研究材料濺射和表面張力對(duì)納米孔大小的影響，利用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（FETEM）強(qiáng)電子束成功地在50nm厚度的Si3N4薄膜上制備出了直徑非常精確的單個(gè)納米孔，最小直徑為2nm；而美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的研究人員E. Sosnov等[17]則利用FETEM在Si3N4薄膜上制備出了10 nm以下的各種形狀（如圓形、三角形等）的納米單孔和孔陣列。除此之外，還發(fā)展出了濕法刻蝕，該方法成本較低，尤其適用于批量制作。清華大學(xué)W. H. Si等人[18, 19]采用離子體干法深刻蝕和氫氧化鉀溶液濕法刻蝕相結(jié)合的手段，精確制備出了直徑為100nm的納米孔陣列和最小直徑為32nm的單納米孔。而J. W. Kim等人[20]利用四甲基氫氧化銨濕法刻蝕硅片，制備出了直徑為130nm的倒金字塔形腔陣列納米孔。

固態(tài)納米孔的制備是一個(gè)非常重要的研究方向，有望為實(shí)現(xiàn)廉價(jià)而快速的個(gè)體基因測(cè)序提供關(guān)鍵的物理基礎(chǔ)，目前在其實(shí)驗(yàn)及理論方面仍有很多值得研究的問(wèn)題。利用固態(tài)納米孔實(shí)現(xiàn)單個(gè)DNA分子的測(cè)序仍有不小的難度，其一即為單個(gè)DNA分子在納米孔中的運(yùn)動(dòng)的控制[21]。如圖4所示，中科院物理所以10 kbp的雙鏈DNA分子為研究對(duì)象，在1mol/L的氯化鉀溶液中，采用5nm大小的納米孔進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分析了大量分子穿過(guò)納米孔時(shí)的電流特性的變化[14]。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[14]

隨著各種新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，基于庫(kù)爾特原理的納米孔技術(shù)已成為當(dāng)前DNA測(cè)序領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，同時(shí)，該技術(shù)在其他生物技術(shù)領(lǐng)域也具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.3 在金屬工業(yè)的應(yīng)用

在冶金工業(yè)中，金屬液體中的夾雜物如氣泡和其他固體顆粒等不僅影響金屬的凝固過(guò)程，而且對(duì)金屬產(chǎn)品本身造成很大的危害。在后續(xù)的成型工藝中，如沖壓、焊接過(guò)程中，金屬產(chǎn)品極有可能因?yàn)榇嬖谌毕荻l(fā)生斷裂等嚴(yán)重事故[7]。除此之外，含有缺陷的金屬產(chǎn)品如汽車(chē)零部件、航天航空工業(yè)中使用的金屬材料等，在其使用過(guò)程中，很可能會(huì)對(duì)國(guó)民的生產(chǎn)生活帶來(lái)潛在的危險(xiǎn)，甚至引發(fā)嚴(yán)重的災(zāi)難性事故。以鋼鐵材料為例，如果鐵水中含有一定量的氣泡和其他顆粒，那么生產(chǎn)出來(lái)的鋼鐵板材或線材，其使用性能如強(qiáng)度、韌性、表面粗糙度和疲勞強(qiáng)度等[7]將無(wú)法滿(mǎn)足工程應(yīng)用的要求。雖然對(duì)于金屬成品而言，通過(guò)采用特定的熱處理或其他方式可減小缺陷的危害，但這些方法作用有限，對(duì)于某些雜質(zhì)無(wú)法根除。因此，在凝固工藝之前，金屬呈液態(tài)時(shí)檢測(cè)出夾雜物十分重要，快速準(zhǔn)確在線地監(jiān)測(cè)相應(yīng)的非金屬夾雜物意義重大[7]。雖然在連鑄和凝固過(guò)程之前，如何檢測(cè)液態(tài)金屬質(zhì)量一直是冶金工程的目標(biāo)之一，但以前使用的方法通常比較低效。以金屬鋁為例，在工業(yè)應(yīng)用中，一般通過(guò)取樣液態(tài)鋁，將其進(jìn)行過(guò)濾以去除大顆粒雜質(zhì)，然后使其凝固，最后在顯微鏡下進(jìn)行金相分析來(lái)檢測(cè)金屬的純凈度（例如PoDFA法）[22]。類(lèi)似的方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且準(zhǔn)確度很低，難以進(jìn)行在線實(shí)時(shí)測(cè)量。目前，在線的測(cè)量方式主要是LIMCA技術(shù)。

庫(kù)爾特原理原本是應(yīng)用于電解質(zhì)溶液，所使用的電壓電流都比較小，似乎與冶金行業(yè)相距甚遠(yuǎn)。然而，麥吉爾大學(xué)冶金工程系的博士生D. Doutre巧妙地借鑒了庫(kù)爾特原理，提出將該原理應(yīng)用于金屬液夾雜物的檢測(cè)過(guò)程[23]。經(jīng)過(guò)Guthrie研究組共同的努力，最終金屬液純凈度檢測(cè)技術(shù)LIMCA (Liquid Metal Cleanliness Analyzer）被成功開(kāi)發(fā)出來(lái)，并很快就被廣泛應(yīng)用于工業(yè)應(yīng)用，尤其是在液態(tài)鋁的夾雜物檢測(cè)上。目前，該技術(shù)已經(jīng)可以檢測(cè)到15微米的金屬液中的夾雜物，具有在線、定量的優(yōu)點(diǎn)[7]。

Guthrie研究組在該技術(shù)方面進(jìn)行了大量的研發(fā)工作，包括實(shí)驗(yàn)、理論推導(dǎo)和數(shù)值模擬，從而使人們對(duì)LIMCA檢測(cè)過(guò)程有了深入的認(rèn)識(shí)。與庫(kù)爾特原理在電解質(zhì)溶液中的應(yīng)用不同，LIMCA技術(shù)的應(yīng)用環(huán)境是液態(tài)金屬，電導(dǎo)率很高，這導(dǎo)致通入同樣的電流，LIMCA技術(shù)得到的電壓脈沖很小，難以檢測(cè)，同時(shí)外界的干擾對(duì)測(cè)量的影響增大[7]，為此，必須通入大電流進(jìn)行檢測(cè)。而在大電流情況下，必須考慮電流自感應(yīng)磁場(chǎng)對(duì)測(cè)量的影響，自感應(yīng)磁場(chǎng)的存在會(huì)對(duì)液態(tài)金屬的流場(chǎng)和顆粒經(jīng)過(guò)小孔區(qū)域的運(yùn)動(dòng)情況產(chǎn)生很大的影響[22]，從而影響檢測(cè)的電壓或電阻脈沖。X. D. Wang等[6, 24-28]通過(guò)數(shù)值建模對(duì)該方法進(jìn)行了深入研究：通過(guò)求解納維斯托克斯方程和麥克斯韋方程組，對(duì)流場(chǎng)和電磁場(chǎng)進(jìn)行了耦合計(jì)算，重點(diǎn)調(diào)查了在小孔周?chē)碾姶琶舾袇^(qū)域內(nèi)的流場(chǎng)分布和顆粒運(yùn)動(dòng)軌跡，以及不同種類(lèi)、不同形狀、不同電導(dǎo)率的顆粒對(duì)電壓脈沖形狀的影響，分析了電壓脈沖的峰值大小、起始時(shí)刻以及起始斜率等，為實(shí)驗(yàn)工作提供了很好的理論指導(dǎo)。

在LIMCA技術(shù)應(yīng)用于金屬檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)工作中，首先需要解決的是如何減小背景噪音的干擾[22]，避免外界電磁場(chǎng)的影響。研究人員通過(guò)使用高靈敏度的電子元件、電磁屏蔽等方法確保了所測(cè)量的電壓脈沖的準(zhǔn)確性。考慮到冶金問(wèn)題的復(fù)雜性，Guthrie研究組首先進(jìn)行了水模型實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證LIMCA的可行性。在已有數(shù)值模擬工作的基礎(chǔ)上，利用APSⅡ (Aqueous Particle Sensor)系統(tǒng)，通過(guò)使用信號(hào)放大器和高精度數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)測(cè)量了相應(yīng)的電壓脈沖的信號(hào)。經(jīng)過(guò)比較實(shí)驗(yàn)所測(cè)的電壓脈沖信號(hào)和數(shù)值模擬結(jié)果，確認(rèn)了LIMCA技術(shù)還可以區(qū)分不同密度的顆粒[23]，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[7]

在可行性分析得到驗(yàn)證之后，研究人員嘗試將LIMCA技術(shù)應(yīng)用于液態(tài)金屬，最開(kāi)始選擇的是液態(tài)的金屬鎵。在金屬液中通入恒定的60A電流后（水溶液中的電流只有20mA[7]），觀測(cè)到了明顯的電壓脈沖信號(hào)。然后研究人員將其應(yīng)用于金屬鋁的檢測(cè)，并在麥吉爾大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中做出了第一套LIMCA裝置。該裝置使用硅酸鹽試管，在試管上鉆孔并進(jìn)行火焰灼燒然后密封。該裝置的成功之處在于小孔的形狀可以促使液態(tài)鋁從小孔流出。在這些實(shí)驗(yàn)工作基礎(chǔ)上，第一臺(tái)用于鋁工業(yè)的商用儀器于1995年在魁北克市被BOMEM公司（現(xiàn)稱(chēng)ABB）成功研發(fā)出來(lái)（LIMCA II），見(jiàn)圖6（a）。該儀器的一大創(chuàng)新之處在于，它使用了四個(gè)外部電極以減小外界的電磁噪音[29, 30]。該儀器已被廣泛應(yīng)用于冶金工業(yè)中，不僅被用于金屬液的純凈度檢測(cè)，也被用于檢測(cè)各種過(guò)濾的有效性。

其后ABB公司研制出了LIMCA CM型儀器（見(jiàn)圖6（b）），使用數(shù)字信號(hào)替換了原有的模擬信號(hào)，同時(shí)將傳感器完全密封于金屬殼中，成功地減小了電磁干擾。目前國(guó)內(nèi)南山輕合金有限公司已經(jīng)引入LIMCA CM來(lái)檢測(cè)金屬鋁的質(zhì)量[7]。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[22]

隨著LIMCA技術(shù)在鋁工業(yè)上的成功應(yīng)用，研究人員也在嘗試將該技術(shù)用于鋼、銅等高溫金屬液的檢測(cè)過(guò)程。其中對(duì)于液態(tài)鋼（熔點(diǎn)為1650℃）的應(yīng)用進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，通過(guò)更換不同的絕緣材料，發(fā)現(xiàn)了明顯的電壓脈沖信號(hào)，但由于電極和探頭的壽命等問(wèn)題，LIMCA在鋼鐵行業(yè)上至今尚未實(shí)現(xiàn)真正的商業(yè)化[7]。

2.4 在工程熱物理方面的應(yīng)用

隨著MEMS等微納技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，導(dǎo)熱過(guò)程在空間尺度和時(shí)間尺度上向著極端情況發(fā)展，關(guān)于微納米尺度上的傳熱過(guò)程的研究和微納米空間內(nèi)的液體沸騰等已成為工程熱物理領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，很多研究人員針對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)、理論和數(shù)值研究工作[31-33]。Lin等[34, 35]通過(guò)加熱絲實(shí)驗(yàn)在微米尺度對(duì)微通道內(nèi)的熱氣泡形成進(jìn)行了研究，引起了科學(xué)界的大量關(guān)注。隨后其他研究人員也針對(duì)微通道內(nèi)的熱氣泡問(wèn)題進(jìn)行了大量研究，使得該方面的研究日漸成熟，而納米尺度的納通道內(nèi)的熱氣泡的問(wèn)題研究尚不充足。最近，研究人員在測(cè)量納通道內(nèi)的電流時(shí)發(fā)現(xiàn)熱氣泡的存在是主要的噪聲源，因此，納米尺度熱氣泡檢測(cè)的重要性逐漸顯現(xiàn)出來(lái)了。

陳敏等提出使用已有的庫(kù)爾特原理，首次成功地考察了納通道內(nèi)受限溶液的熱氣泡成核現(xiàn)象[36]。利用沉積、濺射、腐蝕和電子束光刻等微加工技術(shù)完成了實(shí)驗(yàn)所用器件的加工，其中納通道的高度僅為100納米，如圖7所示。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先在儲(chǔ)液池加入適量的電解液并使其充滿(mǎn)納通道，然后在電極上施加一定的電壓，利用電流的熱效應(yīng)來(lái)加熱電解質(zhì)溶液。為了檢測(cè)納通道內(nèi)的電流變化，實(shí)驗(yàn)中使用電源CSI12001X，通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)，每一分鐘增加定量的電壓，然后記錄電流的變化過(guò)程。通過(guò)分析電流的變化，揭示熱氣泡在納通道內(nèi)的成核現(xiàn)象。最終發(fā)現(xiàn)基于庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器原理的納通道熱氣泡檢測(cè)器可以有效地用于納通道中熱氣泡復(fù)雜行為的研究。

2.5 在化工過(guò)程的應(yīng)用及展望

自庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器被發(fā)明后就已被廣泛應(yīng)用于化工領(lǐng)域，尤其是在多相催化研究領(lǐng)域中的催化劑顆粒檢測(cè)方面。例如在TDA生產(chǎn)過(guò)程中，二硝基甲苯（DNT）在Ni催化劑存在的條件下加氫生成TDA和水，在反應(yīng)過(guò)程中催化劑被不斷攪拌逐漸被磨細(xì)，從而達(dá)到幾微米甚至更小。催化劑沉降以后，大部分大顆粒催化劑被回收利用，而小顆粒的催化劑則繼續(xù)進(jìn)入后續(xù)工序，由于小顆粒催化劑并沒(méi)有完全失活，會(huì)加速焦油的生產(chǎn)，降低產(chǎn)品收率，還會(huì)導(dǎo)致設(shè)備磨損[37]。通過(guò)使用庫(kù)爾特原理，可以成功檢測(cè)出小顆粒催化劑的存在。

圖片來(lái)源：文獻(xiàn)[36]

然而，并非所有的問(wèn)題都可以這樣直接通過(guò)離線的檢測(cè)得到解決。例如在某些化學(xué)工程領(lǐng)域里，由液體和彌散顆粒組成的兩相流問(wèn)題非常重要，而某些化工過(guò)程中液體中微顆粒在特定區(qū)域內(nèi)的濃度和大小分布，以及隨時(shí)間的變化的量也引起了研究人員的注意。在實(shí)際測(cè)量操作過(guò)程中，如果直接取樣檢測(cè)，測(cè)量本身有一定的滯后性，這對(duì)于檢測(cè)某些化工過(guò)程中液體的微顆粒變化以及演化過(guò)程是非常不利的。另一方面，直接將庫(kù)爾特測(cè)試管放在化工液體中會(huì)影響化工過(guò)程液體中的流場(chǎng)，影響化工化學(xué)反應(yīng)過(guò)程以及反應(yīng)環(huán)境，同時(shí)也使得測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確、不可靠。除此之外，由于電阻法為電學(xué)方法，將測(cè)試管靠近待測(cè)區(qū)域可能會(huì)引起較大的電磁干擾?；谏鲜鲈?，王曉東等[38, 39]基于庫(kù)爾特原理，發(fā)明了一種與過(guò)程兼容的微顆粒檢測(cè)裝置和方法，可實(shí)現(xiàn)在線、定時(shí)、定量、連續(xù)測(cè)量液態(tài)中的微顆粒，滿(mǎn)足了對(duì)化工過(guò)程中的微顆粒實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和測(cè)量分析的要求。

3 結(jié)論

庫(kù)爾特原理的發(fā)現(xiàn)來(lái)自于庫(kù)爾特兄弟將辛苦的例行工作變?yōu)樽詣?dòng)化操作的愿望[3]，卻無(wú)意間促使了一系列高精度的自動(dòng)化產(chǎn)品的誕生，和該原理在各個(gè)行業(yè)的廣泛應(yīng)用。隨后，該原理被廣泛借鑒，在短短幾十年的時(shí)間內(nèi)，它已逐漸被應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)。從“一個(gè)孔不可能獲得專(zhuān)利[3]”到如今的庫(kù)爾特商業(yè)帝國(guó)（至1997年被貝克曼公司兼并時(shí)為止，庫(kù)爾特兄弟的公司有員工5000余人，產(chǎn)值幾百億，全球市場(chǎng)占有率98%以上[3]），從簡(jiǎn)陋的地下室實(shí)驗(yàn)條件到如今的一系列高精度自動(dòng)化產(chǎn)品，從單純的血液細(xì)胞檢測(cè)到空氣污染、金屬、基因領(lǐng)域和軍工等領(lǐng)域的應(yīng)用，庫(kù)爾特原理在工業(yè)應(yīng)用上取得了巨大的成功,給科學(xué)研究和工程研究提供了重大的幫助。庫(kù)爾特原理與技術(shù)的發(fā)展深刻地揭示了科學(xué)技術(shù)發(fā)展的一些普適規(guī)律，充分地展示了跨學(xué)科研究在工程中的重要應(yīng)用價(jià)值和驚人的創(chuàng)造力。同時(shí)，給我們?nèi)绾卧诳茖W(xué)研究和工程應(yīng)用上創(chuàng)新、借鑒其他學(xué)科的成果來(lái)服務(wù)本學(xué)科、發(fā)揮跨學(xué)科研究的優(yōu)勢(shì)所在，帶來(lái)了巨大的啟發(fā)意義。

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Coulter Principle and Its Application

Yang Wenzhi, Wang Xiaodong, Li Cheng

(College of Materials Science and Opto-electronic Technology, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

An electrical method using the pulses of the resistance to detect the sizes and numbers of particles, has been developed to an effective way in the detection of the red blood cells and was evaluated to be a professional method in this industry by the US department of health. This technology has obtained the huge achievements in the area of the medical instruments by the Coulter brothers’ own efforts. The principle of the Coulter and its applications in the areas of Cell, gene and metallurgy, has been introduced in detail in this paper. The development of this principle and technology reveals profoundly some universal laws in the development of science and technology and fully shows that the interdisciplinary research is very important in the industrial engineering.

Principle of Coulter; particles; resistance; cells, metallurgy, chemical engineering

10.3724/SP.J.1224.2016.00582

TH70

A

1674-4969(2016)06-0582-11

2016-09-07;

2016-10-12

楊文志（1990–），男，碩士研究生，研究方向?yàn)椴牧系碾姶胚^(guò)程。王曉東（1972–），男，博士，教授，研究方向?yàn)椴牧系碾姶胚^(guò)程。E-mail: xiaodong.wang@ucas.ac.cn李 橙（1993–），女，碩士研究生，研究方向?yàn)椴牧系碾姶胚^(guò)程。