紅曲色素發(fā)酵分批補(bǔ)料工藝研究

顧澄琛，張朝暉，包瑩玲，劉銀蘭，嘉曉勤

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

紅曲色素發(fā)酵分批補(bǔ)料工藝研究

顧澄琛，張朝暉，包瑩玲，劉銀蘭，嘉曉勤*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

為了提高紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000的紅色素色價(jià)，采用優(yōu)化種齡和接種量的方法，探索了分批補(bǔ)料發(fā)酵基質(zhì)對(duì)紅色素色價(jià)的影響。結(jié)果表明，最佳種齡為6 h二級(jí)種子液，接種量10%（V/V），在發(fā)酵48 h時(shí)補(bǔ)加20 g/L黃豆粉，在發(fā)酵84 h時(shí)補(bǔ)加0.5 mol/L氨水，在發(fā)酵96 h時(shí)補(bǔ)加60 g/L米粉。在此工藝條件下，搖瓶發(fā)酵紅曲菌FM-4000的紅色素色價(jià)達(dá)到135.61 U/mL，相對(duì)初始搖瓶紅曲菌FM-4000的紅色素色價(jià)提高了37.25%；在5 L發(fā)酵罐中對(duì)紅曲菌FM-4000進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，紅色素色價(jià)可達(dá)145 U/mL。

紅曲菌；紅色素；分批補(bǔ)料發(fā)酵

紅曲色素是紅曲菌（Monascus）代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列聚酮類化合物，其特點(diǎn)是色澤鮮艷、耐熱性強(qiáng)、安全性高等［1］。隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益重視，天然色素正受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。目前對(duì)紅曲色素的固態(tài)發(fā)酵有大量的報(bào)道［2-3］。而液態(tài)發(fā)酵有利于擴(kuò)大化、自動(dòng)化生產(chǎn)，并且發(fā)酵時(shí)間短、生產(chǎn)消耗少、產(chǎn)品純度高，因此液態(tài)發(fā)酵紅曲色素成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［4-5］。但目前對(duì)液態(tài)發(fā)酵紅曲色素的補(bǔ)料工藝研究甚少［6］，邱鵬等［7］通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)紅曲菌發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，付榮霞等［8］利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同碳源、氮源、pH、裝液量對(duì)紅曲霉色價(jià)及菌體干質(zhì)量的影響。分批補(bǔ)料發(fā)酵能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在某個(gè)階段維持在一定濃度，既可保證發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)的供給，又可以有效地在消除某些基質(zhì)對(duì)產(chǎn)物合成所產(chǎn)生的阻遏或抑制效應(yīng)，因此更有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成［9］。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000液態(tài)發(fā)酵的種齡及接種量進(jìn)行了優(yōu)化，研究其補(bǔ)料發(fā)酵的合適條件，并在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行5 L發(fā)酵罐中紅曲菌（M.purpureus）FM-4000分批補(bǔ)料發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，以期提高液態(tài)發(fā)酵紅曲色素產(chǎn)量及色價(jià)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

紅曲菌（Monascus purpureus）FM-4000：浙江工業(yè)大學(xué)紅曲研究所提供。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：淀粉30 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，黃豆粉10 g/L，玉米漿1%（V/V），pH自然，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：米粉60 g/L，黃豆粉20 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，乳酸調(diào)節(jié)pH 4～5，滅菌前加入消泡劑（泡敵）1‰（V/V），121℃滅菌30 min。

1.1.3化學(xué)試劑

可溶性淀粉：南京化學(xué)試劑有限公司；NaNO3：上海化專實(shí)驗(yàn)二廠；KH2PO4：浙江中星化工試劑有限公司；MgSO4·7H2O：上海四赫維化工有限公司；乳酸：浙江中星化工試劑有限公司；乙醇：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SW-CJ-6型超凈工作臺(tái)：上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；YP202N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造公司；PB-10型pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；BIOSTATRB型5L發(fā)酵罐：德國(guó)Sartorius公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將保藏菌種轉(zhuǎn)接至新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）試管，30℃恒溫培養(yǎng)7 d。

種子培養(yǎng)：用無(wú)菌水洗下斜面上的菌體，制備孢子懸液。取孢子懸液5 mL接至裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h得到一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液按10%（V/V）的接種量接種至裝液量為100mL/250mL的種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，得到二級(jí)種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將二級(jí)種子液按8%（V/V）的接種量接種至裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)168 h。定時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)參數(shù)，測(cè)定結(jié)果為3個(gè)平行樣的平均值。

1.3.2生物量的測(cè)定方法

生物量的測(cè)定采用濕重法。取2mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心15min，取沉淀，加入1mL去離子水，混勻后12 000 r/min離心5 min，除去上清，稱質(zhì)量。

1.3.3色價(jià)的測(cè)定方法

胞外紅色素色價(jià)測(cè)定方法：取2mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心15 min，取上清；上清稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度值OD505nm。胞外紅色素色價(jià)值的計(jì)算公式如下：

胞內(nèi)紅色素色價(jià)測(cè)定方法：取2mL發(fā)酵液，12000r/min離心15min，取沉淀；加入1mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，混勻，超聲10 min，靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清；上清液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)505nm處測(cè)定吸光度值OD505nm。胞內(nèi)紅色素色價(jià)值的計(jì)算公式如下：

總色價(jià)=胞外紅色素色價(jià)+胞內(nèi)紅色素色價(jià)

1.3.4紅曲菌發(fā)酵液中總糖的測(cè)定方法

參照武發(fā)菊等［10］的3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法。

2　結(jié)果與分析

2.1二級(jí)種子種齡的優(yōu)化

研究不同種齡的二級(jí)種子液對(duì)色素色價(jià)的影響，顯微鏡下觀察不同種齡菌落及菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，二級(jí)種子培養(yǎng)6 h時(shí)，發(fā)酵液中菌絲短而粗壯，呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，菌落呈絮狀，致密，生長(zhǎng)快（見(jiàn)圖1）；隨著二級(jí)種子種齡增加，菌體開(kāi)始結(jié)成小球，導(dǎo)致菌球內(nèi)部傳質(zhì)、傳氧發(fā)生困難，難以到達(dá)菌球中心，形成中空型菌球，影響菌體的正常代謝及目標(biāo)產(chǎn)物的合成，最終導(dǎo)致色素積累受到抑制。色價(jià)變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，二級(jí)種子種齡為6 h時(shí)，色價(jià)最高，達(dá)到85.11 U/mL。因此，采用二級(jí)種子種齡6 h為宜。

表1　不同種齡二級(jí)種子菌落及菌絲形態(tài)Table1 Colony and mycelial morphology of the secondary seed of different inoculum ages

圖1　二級(jí)種子培養(yǎng)6 h后菌落和菌絲形態(tài)Fig.1 Colony and mycelial morphology of secondary seed after culture 6 h

圖2　不同種齡對(duì)發(fā)酵液總色價(jià)的影響Fig.2 Effect of different inoculum ages on total color value of fermentation broth

2.2接種量的優(yōu)化

菌株在發(fā)酵液中的生長(zhǎng)速度受接種量影響較大。研究發(fā)酵液中不同接種量對(duì)色價(jià)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，起初紅色素色價(jià)隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)，紅色素色價(jià)達(dá)到最高，為115.67 U/mL；但是當(dāng)接種量為11%時(shí)，發(fā)酵液色價(jià)相對(duì)低。這可能因?yàn)橐环矫骐S著接種量增加，相應(yīng)種子液中水解酶類增加，基質(zhì)利用率增加；另一方面菌株迅速占據(jù)培養(yǎng)環(huán)境，形成優(yōu)勢(shì)菌，雜菌生長(zhǎng)機(jī)會(huì)下降，這兩方面共同導(dǎo)致色價(jià)逐漸增加；但是當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，菌絲生長(zhǎng)過(guò)快，造成溶氧不足，細(xì)胞快速衰老影響色價(jià)。因此，采用10%的接種量比較合適。

圖3　不同接種量對(duì)發(fā)酵液總色價(jià)的影響Fig.3 Effect of different inoculum on total color value of fermentation broth

2.3碳源補(bǔ)加量對(duì)總色價(jià)的影響

殘?zhí)橇吭?4 h后下降速率較快，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到96 h時(shí)，發(fā)酵液殘?zhí)橇繋缀踅禐?，殘?zhí)亲兓闆r如圖4所示。為了保持發(fā)酵的繼續(xù)，以不同質(zhì)量濃度的大米粉為碳源，在96 h補(bǔ)加碳源，補(bǔ)加后發(fā)酵液最終色價(jià)情況如圖5所示。

圖4　發(fā)酵時(shí)間與殘?zhí)橇康年P(guān)系Fig.4 Relationship between fermentation time and residual sugar content

圖5　補(bǔ)加不同質(zhì)量濃度米粉對(duì)總色價(jià)和殘?zhí)橇康挠绊慒ig.5 Effect of different rice flour concentration on total color value and residual sugar concentration

由圖5可知，隨著補(bǔ)加米粉質(zhì)量濃度的增加，色價(jià)逐漸升高，但是，當(dāng)補(bǔ)加米粉質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，色價(jià)降低。這可能是過(guò)高米粉質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，影響色素積累。因此，選擇在發(fā)酵96 h時(shí)補(bǔ)加60 g/L的米粉溶液，此時(shí)色價(jià)達(dá)到130.60 U/mL，殘?zhí)橇繛?.15 mg/mL。

2.4氮源補(bǔ)加量對(duì)總色價(jià)的影響

發(fā)酵過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)與氮源含量有很大關(guān)系。通過(guò)補(bǔ)加氮源，補(bǔ)充菌體發(fā)酵過(guò)程對(duì)氮源的消耗，提高色價(jià)。發(fā)酵過(guò)程中色價(jià)、pH、菌體濕質(zhì)量變化曲線見(jiàn)圖6。

圖6　發(fā)酵過(guò)程中總色價(jià)、pH、菌體濕質(zhì)量變化曲線Fig.6 Variation curve of total color value，pH and wet mass during fermentation

由圖6可知，0～12 h菌體生長(zhǎng)緩慢，屬于菌體生長(zhǎng)的遲滯期，色素生成量較少，pH為6.5左右；12～48 h菌體量迅速增長(zhǎng)，達(dá)到0.73 g/mL，色素生成量增加；48～84 h階段，是色素生成的黃金時(shí)期，菌體量相對(duì)穩(wěn)定在0.83g/mL。84～120 h，菌體生長(zhǎng)呈現(xiàn)衰退，菌體量下降，色價(jià)依然緩慢上升，在發(fā)酵96 h時(shí)色價(jià)達(dá)到115.80 U/mL，此后色價(jià)下降，這與菌體開(kāi)始出現(xiàn)自溶，產(chǎn)色素能力下降有關(guān)。

在發(fā)酵48 h時(shí)分別補(bǔ)加不同氮源（質(zhì)量濃度為2 g/L），探究快速生長(zhǎng)期補(bǔ)加氮源對(duì)色價(jià)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7　不同氮源對(duì)總色價(jià)的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on total color value

由圖7可知，使用無(wú)機(jī)氮源（NaNO3、氨水）后色價(jià)較低，分別是85.40 U/mL，60.61 U/mL；而使用有機(jī)類氮源（黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨）后，色價(jià)分別達(dá)到120.51 U/mL、123.06 U/mL和115.90 U/mL。這與有機(jī)氮源中含有的生長(zhǎng)因子和一些無(wú)機(jī)鹽極大地促進(jìn)了菌絲體生長(zhǎng)量［11］，從而促進(jìn)色素發(fā)酵過(guò)程的積累［12-14］有關(guān)，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的成本問(wèn)題，選擇黃豆粉作為補(bǔ)加氮源。

考察黃豆粉的添加量對(duì)總色價(jià)影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，在紅曲菌（Monascus purpureus）FM4000發(fā)酵液中色價(jià)隨黃豆粉質(zhì)量濃度增加而上升，在黃豆粉質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，色價(jià)達(dá)到最高，為123.80 U/mL。但當(dāng)補(bǔ)加黃豆粉質(zhì)量濃度＞20 g/L后，發(fā)酵液中菌體生物量繼續(xù)增加，但色價(jià)卻沒(méi)有隨之增加，反而降低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是培養(yǎng)基中黃豆粉質(zhì)量濃度過(guò)高導(dǎo)致了發(fā)酵液氮源十分充足，被大量用于生產(chǎn)菌體，而抑制了次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。因此，在發(fā)酵48 h時(shí)添加20 g/L黃豆粉。

圖8　黃豆粉添加量對(duì)總色價(jià)及菌體濕質(zhì)量的影響Fig.8 Effect of soybean powder addition on total color value and biomass

2.5氨水補(bǔ)加量對(duì)總色價(jià)的影響

在84～120 h菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，此時(shí)pH在5.5～4.5時(shí)，接近發(fā)酵終點(diǎn)。此時(shí)根據(jù)紅曲色素代謝途徑中存在的加氨反應(yīng)，在發(fā)酵84 h時(shí)通過(guò)補(bǔ)加氨水，促進(jìn)橙色素向紅色素轉(zhuǎn)化。研究不同氨水濃度對(duì)色價(jià)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9　不同濃度氨水對(duì)總色價(jià)及菌體濕質(zhì)量的影響Fig.9 Effect of different ammonia concentration on total color value and biomass

由圖9可知，氨水補(bǔ)加濃度為0.5 mol/L時(shí)，發(fā)酵液色價(jià)達(dá)到最高，為135.61 U/mL，相對(duì)初始搖瓶紅曲霉色素色價(jià)提高了37.25%；而過(guò)高濃度的氨水導(dǎo)致菌體分解，從而抑制了紅色素的生成。因此，在發(fā)酵84h補(bǔ)加0.5mol/L氨水溶液。

2.6發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

圖10　紅曲菌FM-4000在5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中pH（A）、生物量（B）、殘?zhí)橇浚–）及總色價(jià)（D）的變化Fig.10 Changes of pH（A），biomass（B），residue sugar content（C）and total color value（D）duringM.purpureus FM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermenter

綜合上述優(yōu)化后條件，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料驗(yàn)證試驗(yàn)?？刂茀?shù)為：0～24h，轉(zhuǎn)速300r/min，調(diào)節(jié)通氣量為0.5vvm；24～84h，轉(zhuǎn)速500r/min，條件通氣量為0.7vvm；84～132h，轉(zhuǎn)速400r/min，調(diào)節(jié)通氣量為0.3vvm。分別在24h補(bǔ)加20g/L黃豆粉溶液，在132 h補(bǔ)加0.5 mol/L氨水溶液，發(fā)酵84 h、120 h分別補(bǔ)加60 g/L米粉溶液，每隔12 h取樣檢測(cè)發(fā)酵液的pH、菌體濕質(zhì)量、殘?zhí)橇考翱偵珒r(jià)，發(fā)酵過(guò)程曲線如圖10所示。

由圖10可知，在24 h補(bǔ)加有機(jī)氮源黃豆粉，同時(shí)，殘?zhí)橇肯陆递^快，這與紅曲菌（M.purpureus）FM-4000處于快速生產(chǎn)期，代謝旺盛有很大關(guān)系。在發(fā)酵84 h、120 h時(shí)，發(fā)酵液中殘?zhí)呛亢艿?，因此?4 h、120 h處補(bǔ)加米粉。在132 h補(bǔ)加氨水溶液，色素最終產(chǎn)量達(dá)到145 U/mL。

3　結(jié)論

在搖瓶中優(yōu)化產(chǎn)紅色素紅曲菌M.purpureusFM-4000二級(jí)種子的培養(yǎng)時(shí)間、接種量，并探索補(bǔ)加碳源、補(bǔ)加氮源對(duì)總色價(jià)的影響。結(jié)果表明：以6 h培養(yǎng)二級(jí)種子，10%（V/V）接種量，在48 h時(shí)補(bǔ)加20 g/L黃豆粉，在84 h補(bǔ)加0.5 mol/L氨水，96 h補(bǔ)加60 g/L米粉溶液，搖瓶發(fā)酵紅色素的色價(jià)達(dá)到135.61 U/mL，相對(duì)初始搖瓶色素色價(jià)提高了37.25%；在搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在5 L發(fā)酵罐中對(duì)M.purpureusFM-4000進(jìn)行分批補(bǔ)料［15-16］發(fā)酵培養(yǎng)，紅色素色價(jià)可達(dá)145 U/mL。

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GU Chengchen，ZHANG Zhaohui，BAO Yingling，LIU Yinlan，JIA Xiaoqin*
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

In order to improve the color value of red pigment produced byMonascus purpureus，the inoculum age and inoculum were optimized，and the effect of fed-batch fermentation substrate on the color value of red pigment was researched.Results showed that the optimum conditions were inoculum age 6 h，inoculum 10%（V/V），feeding 20 g/L soybean meal at fermentation 48 h，0.5 mol/L aqueous ammonia at 84 h and 60 g/L rice flour at 96 h.Under the conditions，the color value of red pigment produced byM.purpureusFM-4000 in shake flask fermentation was up to 135.61 U/ml，which was 37.25%higher than that before optimization.The color value of red pigment was up to 145 U/ml afterM.purpureusFM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermentor.

Monascus purpureus；red pigment；fed-batch fermentation

TQ92

0254-5071（2016）06-0133-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.028

2016-05-03

國(guó)家文物局指南針計(jì)劃項(xiàng)目（No.20130306）

顧澄?。?989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

嘉曉勤（1972-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)和微生物發(fā)酵工程。