乙二胺四乙酸二酐對(duì)草酸脫羧酶的修飾改性

賀俊斌，林日輝，龍寒，巫佳，蔡杏華，楊穎，陳盛峰

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乙二胺四乙酸二酐對(duì)草酸脫羧酶的修飾改性

賀俊斌1，林日輝2，龍寒1，巫佳1，蔡杏華1，楊穎1，陳盛峰1

(1廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007）

為提高草酸脫羧酶（Oxdc）在預(yù)防治療泌尿系結(jié)石癥方面的穩(wěn)定性和應(yīng)用性能，采用乙二胺四乙酸二酐（EDTAD）對(duì)Oxdc進(jìn)行化學(xué)修飾，并初步優(yōu)化了修飾條件：當(dāng)修飾反應(yīng)時(shí)間為8 h、EDTAD/Oxdc的摩爾比為50:1、反應(yīng)pH為7.0、反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，修飾率為71.91%，酶活回收率為75.42%。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）聯(lián)用分析證明Oxdc和EDTAD共價(jià)結(jié)合成功。紫外-可見(jiàn)吸收光譜（UV）和圓二色性光譜（CD）分析結(jié)果表明，修飾后Oxdc的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的改變。同時(shí)，部分酶學(xué)性質(zhì)研究表明，經(jīng)EDTAD修飾后的Oxdc較游離的Oxdc，最適pH向堿性方向偏移了約1.5個(gè)單位，耐熱性和耐胰蛋白酶酶解的能力均顯著增強(qiáng)。此外，修飾后的Oxdc在草酸鈣上的吸附量明顯提高。結(jié)果說(shuō)明修飾后的Oxdc的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，應(yīng)用性能有所改善。

泌尿系結(jié)石；酶；草酸脫羧酶；純化；乙二胺四乙酸二酐；化學(xué)修飾；吸附

引 言

泌尿系結(jié)石中70%～80%的結(jié)石為草酸鈣結(jié)石[1-2]。目前，雖然可以通過(guò)體外沖擊波碎石術(shù)、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)、輸尿管鏡碎石術(shù)、化學(xué)藥物治療等物理和化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行治療[3]，并取得了一定的療效；然而，物理、化學(xué)方法的治療費(fèi)用昂貴、對(duì)人體副作用較大，且草酸鈣結(jié)石具有較高的復(fù)發(fā)率，這給患者帶來(lái)了極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。生物酶具有高效性、專一性和溫和性等作用特點(diǎn)，而人體內(nèi)缺乏降解草酸 (草酸鹽)的相關(guān)代謝途徑是導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石的一個(gè)重要原因，因此，利用草酸代謝酶催化降解人體內(nèi)的草酸(草酸鹽)，以預(yù)防和治療草酸鈣結(jié)石癥已成為目前重要的研究方向。

目前，自然界中已發(fā)現(xiàn)有3種草酸降解酶：草酸脫羧酶（EC 4.1.1.2）、草酸氧化酶（EC 1.2.3.4）和草酰輔酶A脫羧酶（EC 4.1.1.8）[4-5]。草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，Oxdc，EC 4.1.1.2）能夠催化裂解草酸的CC鍵，在沒(méi)有輔因子的參與下即可催化降解草酸（草酸鹽）生成甲酸（甲酸鹽）和CO2，是植物及微生物中草酸代謝降解的主要催化酶。由于該酶在酶促反應(yīng)過(guò)程中的高效性及對(duì)底物的高度特異性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域中草酸（草酸鹽）的降解[5-7]。尤其在防治草酸鈣結(jié)石癥方面，采用Oxdc降解人體內(nèi)的草酸（草酸鹽）成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Grujic等[8]以基因敲除小鼠為模型，通過(guò)口服交聯(lián)Oxdc晶體（OxDc-CLEC），發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)糞草酸和尿草酸分別降低了72%和44%。Jeong等[9]模擬高草酸尿癥模型，給小鼠口服來(lái)源于.的重組Oxdc，發(fā)現(xiàn)小鼠尿液中草酸的水平有效地減少了。Cowley等[10]以狗和大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，口服酶制劑Oxazyme（OC4）連續(xù)飼喂14 d，評(píng)價(jià)了用于催化降解動(dòng)物消化道中草酸的酶制劑的毒性，結(jié)果表明，對(duì)狗使用劑量為187.2 mg·kg-1·d-1，對(duì)大鼠使用劑量為720.8 mg·kg-1·d-1均無(wú)可見(jiàn)有害作用水平。Shenoy等[11]運(yùn)用交聯(lián)酶晶體法（CLECs）制成Oxdc酶制劑用于治療草酸鹽結(jié)石癥以及Sidhu等[12]運(yùn)用噴霧干燥法制成重組Oxdc顆粒用于減少胃腸吸收的草酸含量，均取得了良好的效果。此外，本課題組前期研究也證明了Oxdc促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶重新溶解的作用[13]。這些研究都表明，利用Oxdc制劑催化降解消化道內(nèi)的草酸（草酸鹽）以預(yù)防治療草酸鈣結(jié)石癥的方法是可行的。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，尿液處于流動(dòng)的狀態(tài)，Oxdc制劑到達(dá)泌尿系統(tǒng)中則面臨酶蛋白易被稀釋和流失的問(wèn)題。如果首先對(duì)Oxdc進(jìn)行修飾改性，使其對(duì)草酸鈣晶體具有較強(qiáng)的吸附能力，然后選擇合適的方式給藥，使修飾后的酶制劑到達(dá)泌尿系統(tǒng)后既可高效吸附固定于草酸鈣晶體上，較長(zhǎng)時(shí)間維持結(jié)合在草酸鈣結(jié)石部位的酶制劑濃度，又可發(fā)揮酶催化降解草酸（草酸鹽）促進(jìn)草酸鈣溶解的能力。

酶化學(xué)修飾是改進(jìn)酶性能的有效方法。目前，常見(jiàn)的化學(xué)修飾劑包括烷基化試劑、酸酐、二羰基化合物等小分子修飾劑，戊二醛、羰二亞胺、葡萄糖二乙醛等雙功能基團(tuán)試劑以及如聚乙二醇、右旋糖酐、丙烯酸多聚物等大分子修飾劑[14]。本課題組前期采用單甲氧基聚乙二醇及右旋糖酐對(duì)Oxdc進(jìn)行修飾改性，其穩(wěn)定性得到了有效提高[15-17]。而采用酸酐對(duì)Oxdc進(jìn)行修飾改性目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究 采用乙二胺四乙酸二酐（ethylenediaminetetraacetic dianhydride，EDTAD）對(duì)Oxdc進(jìn)行修飾改性，分析修飾后Oxdc的生物活性及結(jié)構(gòu)變化，并探討EDTAD修飾對(duì)Oxdc部分酶學(xué)性質(zhì)和催化吸附性能的影響，為其應(yīng)用于防治草酸鈣結(jié)石癥提供理論 參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基因工程菌.BL21(DE3)/pET32a/YvrK，本實(shí)驗(yàn)室保存；LB培養(yǎng)基組成：1 L培養(yǎng)基含蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g；LB固體培養(yǎng)基添加18 g瓊脂粉。

草酸鉀、甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）、2,4,6-三硝基苯磺酸（picrylsulfonic acid solution，TNBS）、-甲苯磺?；?L-苯基丙氨酸氯甲基酮（-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone，TPCK）-胰蛋白酶（測(cè)序級(jí)），美國(guó)Sigma公司；氨芐青霉素，美國(guó)Amresco公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG），德國(guó)Merck公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD），瑞士Roche公司；EDTAD，天津希恩思生化科技有限公司；乙腈（色譜級(jí)），美國(guó)Fisher Scientific公司；甲酸（色譜級(jí)），阿拉?。黄渌噭┚鶠閲?guó)產(chǎn)分析純。

SDS-PAGE預(yù)制膠，上海伯楷安生物科技有限公司；HisTrapTMHP親和柱、?KTAprime plus快速低壓液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare集團(tuán)；凝膠電泳成像分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；CR-22G高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；Sigma 1-13高速臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；超低溫冰箱，美國(guó)Beckman公司；4℃冰箱，中國(guó)海爾集團(tuán)；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；MOS-450圓二色譜儀，法國(guó)BioLogic公司；Waters液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)和XEVO G2-S QTOF質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Oxdc的制備及酶活力檢測(cè) Oxdc的制備參考文獻(xiàn)[18]。培養(yǎng)發(fā)酵基因工程菌.BL21(DE3)/pET32a/YvrK至OD600約0.6，將發(fā)酵物42℃熱沖擊5 min，添加IPTG至終濃度0.4 mmol·L-1誘導(dǎo)表達(dá)Oxdc，離心（4℃，8000 r·min-1，15 min）發(fā)酵液并收集菌體，然后以pH 8.0（50 mmol·L-1）的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸菌體，重溶菌液在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，離心，上清液即為粗酶液；用?KTAprime plus快速低壓液相色譜系統(tǒng)對(duì)粗酶液進(jìn)行純化，所得純化酶液轉(zhuǎn)入預(yù)先處理好的透析袋（截留分子量8000～14000）中，于50 mmol·L-1pH 8.0的PBS中4℃下透析過(guò)夜，然后用超濾濃縮管濃縮至一定濃度，所得酶液為野生酶（Oxdc）供試酶液。

Oxdc的酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。酶活力單位定義為：每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生1 μmol甲酸的酶量。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 EDTAD對(duì)Oxdc的修飾 將EDTAD和Oxdc按摩爾比0.5:1～100:1分別溶于50 mmol·L-1不同pH（pH 3.0～9.0）的PBS中，4～45℃攪拌反應(yīng)1～24 h；在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中用 0.1 mol·L-1NaOH溶液維持反應(yīng)體系的 pH 至恒定值；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入預(yù)先處理好的透析袋（截留分子量8000～14000）中，于50 mmol·L-1pH 8.0的PBS中4℃下透析過(guò)夜，以除掉殘余的修飾劑等雜質(zhì)，然后用超濾濃縮管濃縮至一定濃度，所得溶液作為修飾酶（EDTAD-Oxdc）供試酶液。

Oxdc的修飾程度的測(cè)定采用TNBS法[20]。TNBS與酶蛋白表面的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，生成三硝基苯衍生物，在420 nm有特征吸收峰。修飾率MR按式（1）計(jì)算

式中，0為Oxdc在420 nm下的光吸收值，1為EDTAD-Oxdc在420 nm下的光吸收值，0為修飾前Oxdc的濃度，1為修飾后經(jīng)透析和濃縮所得酶的濃度。在檢測(cè)時(shí)，TNBS用雙蒸水稀釋至1 g·L-1，以降低TNBS濃度過(guò)大對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

酶活回收率RR按式（2）計(jì)算

式中，0為用于修飾反應(yīng)的Oxdc的酶活，1為修飾后經(jīng)透析濃縮所得酶的酶活，0為修飾前Oxdc的濃度，1為修飾后經(jīng)透析和濃縮所得酶的濃度。

1.2.3 SDS-PAGE分析 采用梯度膠濃度為4%～20%的SDS-PAGE電泳分析Oxdc和EDTAD-Oxdc的分子量變化。

1.2.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）分析 取TPCK-胰蛋白酶適量，用50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）溶解制成濃度為1 mg·ml-1的溶液，分裝后放入-20℃冰箱冷凍，備用。

分別取蛋白濃度均為2 mg·ml-1的Oxdc和EDTAD-Oxdc125 μl，各加50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）1 ml，按50:1（質(zhì)量比）的比例（酶液/TPCK-胰蛋白酶溶液）加入TPCK-胰蛋白酶溶液，混勻，37℃水浴保溫酶解12 h，取出，100℃水浴加熱15 min終止反應(yīng)，12000 r·min-1離心5 min，收集上清液，4℃?zhèn)溆茫M(jìn)樣前用0.45 μm的針頭過(guò)濾器去除不溶物。另以不加Oxdc和EDTAD-Oxdc，其他同法操作，作為酶解空白。

UPLC條件：實(shí)驗(yàn)使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)；色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1×100 mm）；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為10 μl；梯度洗脫程序見(jiàn)表1[流動(dòng)相A：0.1%（體積）甲酸/水；流動(dòng)相B：0.1%（體積）甲酸/乙腈]。MS條件：聯(lián)用的質(zhì)譜儀為Waters XEVO G2-S QTOF；ESI+電離模式，毛細(xì)管電壓為2.7 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為100℃，脫溶劑氣溫度為350℃，錐孔反吹氣流量為20 L·h-1，脫溶劑氣流量為800 L·h-1，碰撞能為6 V，檢測(cè)器電壓為2575 V，掃描范圍為/100～7000。

表1 梯度洗脫程序

1.2.5 紫外-可見(jiàn)吸收光譜（UV）分析 采用TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，樣品掃描波長(zhǎng)為200～600 nm，石英比色皿光程為 10 mm，酶蛋白濃度為0.2～1.0 mg·ml-1。

1.2.6 圓二色性光譜（CD）分析 采用MOS-450圓二色譜儀，波長(zhǎng)掃描范圍為180～250 nm，帶寬1 nm；使用石英比色池的光程為1 mm。所得數(shù)據(jù)采用SELCON3算法[21-22]分析修飾前后Oxdc的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化。

1.2.7 部分酶學(xué)性質(zhì) 酶最適反應(yīng)pH的測(cè)定：在pH 3.0～6.5的檸檬酸鹽緩沖體系（50 mmol·L-1）中，分別測(cè)定相同蛋白濃度的Oxdc和EDTAD-Oxdc的酶活力，以同組實(shí)驗(yàn)中酶活力最高數(shù)據(jù)為100%酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活。

溫度對(duì)酶活力的影響：在各自最適反應(yīng) pH下，分別測(cè)定相同蛋白濃度的Oxdc和EDTAD-Oxdc在不同溫度（45～75℃）下熱處理30 min的酶活力，觀察熱處理后酶活力的變化；分別將相同蛋白濃度的Oxdc和EDTAD-Oxdc在65℃條件下水浴，不同時(shí)間取樣測(cè)定酶活力。以同組實(shí)驗(yàn)中酶活力最高數(shù)據(jù)為100%酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活。

對(duì)胰蛋白酶的耐受性：取相同蛋白濃度的Oxdc和EDTAD-Oxdc各2.25 ml，分別加入0.25 ml胰蛋白酶溶液（2.5 mg·ml-1），37℃下水浴，定時(shí)取樣，分別在各自最適反應(yīng) pH下測(cè)定殘余酶活力，以起始活性數(shù)據(jù)為100%酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活，分析胰蛋白酶消化對(duì)Oxdc和EDTAD-Oxdc的影響。

1.2.8 吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取1.0 g一水草酸鈣晶體于50 ml的具塞磨口錐形瓶中，分別加入一定體積的pH 7.0的一水草酸鈣飽和溶液，再分別加入已滅活的Oxdc和EDTAD-Oxdc至終濃度均為2 mg·ml-1，使吸附體系總體積為20 ml；后在 （37.0±0.5）℃下恒溫振蕩進(jìn)行吸附反應(yīng)4 h，離心分離，測(cè)定上清液中的蛋白濃度，計(jì)算吸附量。吸附量（e，mg·m-2）按式（3）計(jì)算

式中，0為Oxdc和EDTAD-Oxdc的初始濃度，mg·ml-1；e為Oxdc和EDTAD-Oxdc的平衡濃 度，mg·ml-1；為溶液體積，ml；為一水草酸鈣的比表面積（實(shí)驗(yàn)測(cè)得一水草酸鈣的比表面積約為2.65 m2·g-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Oxdc的誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，實(shí)驗(yàn)測(cè)得野生酶酶活力為14.76 U·ml-1，蛋白質(zhì)含量為8.79 mg·ml-1；親和層析分離結(jié)果如圖1所示。

圖1 Oxdc粗提液親和層析洗脫曲線

2.2 EDTAD修飾Oxdc的條件初步優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾的影響 考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)EDTAD修飾Oxdc的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，修飾率增加，而酶活回收率隨之下降。修飾反應(yīng)進(jìn)行1 h及2 h的酶活回收率分別為90.90%和86.10%，而修飾率僅為16.37%和38.99%；當(dāng)修飾反應(yīng)進(jìn)行8 h時(shí)，修飾率為67.50%，酶活回收率為74.55%；繼續(xù)修飾反應(yīng)達(dá)24 h時(shí)，修飾率為76.95%，但酶活回收率比8 h降低20.99%,為58.90%。可見(jiàn)修飾反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)不同程度地降低酶活回收率，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇修飾反應(yīng)時(shí)間為8 h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間的影響

2.2.2 EDTAD/Oxdc摩爾比對(duì)修飾的影響 不同EDTAD/Oxdc摩爾比對(duì)修飾反應(yīng)的影響結(jié)果如圖3所示。當(dāng)EDTAD/Oxdc摩爾比為1:1時(shí)，酶活回收率為85.10%，而修飾率僅為39.66%；當(dāng)EDTAD/Oxdc摩爾比增加到100:1時(shí)，修飾率達(dá)88.77%，而酶活回收率降低到60.76%。EDTAD/Oxdc摩爾比為50:1時(shí)，修飾率為65.26%，酶活回收率為68.88%?？紤]到EDTAD用量過(guò)大會(huì)對(duì)Oxdc的活性位點(diǎn)及空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)選擇EDTAD/Oxdc的摩爾比為50:1。

圖3 EDTAD/Oxdc摩爾比的影響

2.2.3 pH對(duì)修飾的影響 如圖4所示，在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)，酶活回收率隨著pH的增加而增大；而pH高于7.0后，酶活回收率隨著pH的增大而減小。當(dāng)pH 5.0時(shí)，達(dá)到最高修飾率68.42%，而酶活回收率為59.46%，推測(cè)由于Oxdc的等電點(diǎn)在5.1左右[23]，當(dāng)反應(yīng)體系的pH接近5.1時(shí)，酶蛋白上的自由氨基增多，修飾反應(yīng)活性增大。而當(dāng)pH 7.0時(shí)，修飾率較pH 5.0時(shí)降低14.38%，但酶活回收率比pH 5.0時(shí)增加44.52%，為85.93%。為了獲得較高的酶活回收率和較高的修飾率，修飾反應(yīng)的最適pH選擇為7.0。

圖4 反應(yīng)pH的影響

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)修飾的影響 反應(yīng)溫度對(duì)EDTAD修飾Oxdc的影響結(jié)果如圖5所示。在4～45℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高修飾率有一定程度的增加，而酶活回收率隨之減小。當(dāng)反應(yīng)溫度為4℃時(shí)，修飾率為46.54 %，酶活回收率達(dá)到最大值92.27%；而當(dāng)反應(yīng)溫度為45℃時(shí)，修飾率達(dá)到最高值73.24%，但酶活損失近50%。當(dāng)反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，具有較高的修飾率（71.91%）和較高的酶活回收率（75.42%），本實(shí)驗(yàn)選擇修飾反應(yīng)的溫度為37℃。

圖5 反應(yīng)溫度的影響

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

EDTAD是一種雙功能團(tuán)的試劑，其與Oxdc 中的氨基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)歷程可按以下兩條路線

當(dāng)反應(yīng)按路線Ⅰ反應(yīng)時(shí)，一分子EDTAD與Oxdc中的一個(gè)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)；而當(dāng)反應(yīng)按路線Ⅱ進(jìn)行時(shí)，一分子EDTAD同時(shí)與兩個(gè)Oxdc蛋白分子上的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成結(jié)合兩分子Oxdc的二聚體產(chǎn)物。SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖6。Oxdc亞基的分子量約為43×103，根據(jù)條帶譜型推測(cè)，EDTAD修飾Oxdc的反應(yīng)路線按上述的路線Ⅰ進(jìn)行，因?yàn)橛镜牢闯霈F(xiàn)按路線Ⅱ反應(yīng)的理論修飾產(chǎn)物的顯色條帶。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，EDTAD-Oxdc的條帶遷移速度較Oxdc的緩慢，說(shuō)明EDTAD-Oxdc的分子量高于Oxdc的。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了EDTAD對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的修飾反應(yīng)，根據(jù)修飾產(chǎn)物的條帶譜型，修飾后的BSA條帶單一，說(shuō)明EDTAD修飾BSA的反應(yīng)也是按上述的路線Ⅰ進(jìn)行。這可能是由于酶蛋白分子的空間立體結(jié)構(gòu)阻礙了其與EDTAD反應(yīng)的活性，使得反應(yīng)向有利于進(jìn)行的路線Ⅰ進(jìn)行。

圖6 SDS-PAGE分析結(jié)果

2.4 UPLC-MS分析結(jié)果

經(jīng)TPCK處理過(guò)的胰蛋白酶可專一性地水解Oxdc中賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的羧基端。但在實(shí)際情況下得到的酶解肽段與理論肽段并不一致，因?yàn)椴皇撬械拿附馕稽c(diǎn)都同時(shí)發(fā)生了酶解。Oxdc和EDTAD-Oxdc經(jīng)TPCK-胰蛋白酶酶解，其酶解樣品采用UPLC-MS聯(lián)用技術(shù)分析，得到的總離子流圖經(jīng)Waters公司的BiopharmaLynx軟件分析對(duì)比，結(jié)果表明：EDTAD修飾Oxdc的位點(diǎn)位于Oxdc側(cè)鏈的自由氨基和N端的-氨基上，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，這與Gregg等[24]采用EDTAD修飾瘦素蛋白（rhu-met-leptin）得到的結(jié)果類似。

表2 UPLC-MS分析結(jié)果

2.5 UV分析結(jié)果

蛋白質(zhì)在紫外線范圍內(nèi)有兩個(gè)特征吸收峰，一是蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）等殘基在280 nm處有一個(gè)特征吸收峰；二是因蛋白質(zhì)含有肽鍵，在200～220 nm處有一個(gè)特征吸收峰。由圖7可知，Oxdc的最大吸收波長(zhǎng)為209.8 nm，而EDTAD-Oxdc的最大吸收波長(zhǎng)在212.6 nm處。經(jīng)EDTAD修飾后，Oxdc的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，這可能是因?yàn)镋DTAD的引入改變了酶分子的微環(huán)境，n和軌道間的能量差減小，使得Oxdc的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)[25]。最大吸收波長(zhǎng)的微小變化說(shuō)明Oxdc經(jīng)EDTAD修飾后其分子構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化。

圖7 UV分析結(jié)果

2.6 CD分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。由表3可知，Oxdc經(jīng)EDTAD修飾后，α-螺旋、β-折疊的含量有所減少，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量有所增加。說(shuō)明經(jīng)EDTAD修飾后，Oxdc的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化。

表3 原酶液和修飾酶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化

2.7 部分酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.7.1 Oxdc和EDTAD-Oxdc的最適pH比較 由圖8可知，Oxdc的最適pH為3.5，而EDTAD-Oxdc的最適pH為5.0。經(jīng)EDTAD修飾后，Oxdc的最適pH向堿性方向偏移了約1.5個(gè)單位。這與Sangeetha等[26]采用不同酸酐（檸康酸酐、鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐、馬來(lái)酸酐）修飾木瓜蛋白酶、熊亞紅等[27]采用不同酸酐（鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐、馬來(lái)酸酐）修飾漆酶以及張靜等[25]采用丁二酸酐修飾枯草芽孢桿菌氨肽酶得到的修飾酶的最適pH向堿性方向偏移的結(jié)果類似。這可能是由于EDTAD與Oxdc分子中的賴氨酸（Lys）殘基上帶正電荷的氨基反應(yīng)后，在Oxdc分子中引入了帶負(fù)電荷的羧基，使得最適pH增加了[28]。

圖8 Oxdc和EDTAD-Oxdc的最適pH比較

2.7.2 Oxdc和EDTAD-Oxdc的熱穩(wěn)定性比較 由圖9(a)可知，Oxdc和EDTAD-Oxdc的酶活力隨溫度的變化其趨勢(shì)基本相同，都在45℃時(shí)酶活力達(dá)到最高；但EDTAD-Oxdc較野生酶表現(xiàn)出較好的耐熱性，修飾酶經(jīng)75℃熱處理30 min后，相對(duì)酶活仍保留一半以上，而Oxdc的相對(duì)酶活僅為24.41%。Oxdc和EDTAD-Oxdc在65℃水浴熱處理的結(jié)果見(jiàn)圖9(b)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Oxdc和EDTAD-Oxdc的酶活力均降低。65℃熱處理0.5 h，EDTAD-Oxdc的相對(duì)酶活保留83.26%，而Oxdc的相對(duì)酶活降至62.11%；繼續(xù)水浴至3.0 h時(shí)，Oxdc的相對(duì)酶活為24.80%，而EDTAD-Oxdc的相對(duì)酶活較野生酶高約9.36%。這些結(jié)果說(shuō)明與Oxdc相比，經(jīng)過(guò)EDTAD修飾后的Oxdc表現(xiàn)出較高的耐高溫能力，具有較好的熱穩(wěn)定性。這與Sangeetha等[26]、熊亞紅等[27]、張靜等[25]的研究結(jié)果類似。這可能是因?yàn)樾揎梽┡c酶分子共價(jià)連接后，使得Oxdc分子的結(jié)構(gòu)變得更加緊密，其分子內(nèi)的作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致Oxdc的熱穩(wěn)定性提高[29]。

圖9 Oxdc和EDTAD-Oxdc的熱穩(wěn)定性比較

2.7.3 Oxdc和EDTAD-Oxdc對(duì)胰蛋白酶的耐受性比較 如圖10所示，隨著胰蛋白酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Oxdc和EDTAD-Oxdc的酶活變化趨勢(shì)相同。Oxdc經(jīng)胰蛋白酶處理1.0 h，相對(duì)酶活降至68.88%，而EDTAD-Oxdc仍保留了80%以上的酶活；當(dāng)處理24 h時(shí)，EDTAD-Oxdc較Oxdc保留了高約5%的相對(duì)酶活。結(jié)果表明，經(jīng)EDTAD修飾后，Oxdc的抗胰蛋白酶水解能力顯著增強(qiáng)。關(guān)于Oxdc經(jīng)化學(xué)修飾后抗胰蛋白酶水解的研究有少量報(bào)道。梁躍等[15]采用無(wú)載體固定法交聯(lián)Oxdc，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶處理48 h，交聯(lián)Oxdc的殘余酶活力較游離Oxdc的高30%多。韋成昱等[16-17]采用右旋糖酐和單甲氧基聚乙二醇修飾Oxdc，發(fā)現(xiàn)修飾酶抗胰蛋白酶消化的能力明顯提高。

圖10 Oxdc和EDTAD-Oxdc對(duì)胰蛋白酶的耐受性比較

2.8 Oxdc和EDTAD-Oxdc在一水草酸鈣上的吸附比較

由圖11可知，Oxdc經(jīng)EDTAD修飾后在一水草酸鈣上的吸附能力顯著提高。實(shí)驗(yàn)測(cè)得，經(jīng)EDTAD修飾的Oxdc在一水草酸鈣上的吸附量較未修飾的Oxdc約提高了42.42%。這可能與Oxdc經(jīng)過(guò)EDTAD修飾后，酶分子中引入了較多的羧基，增加了其與一水草酸鈣上的Ca2+的結(jié)合能力有關(guān)。上述結(jié)果說(shuō)明采用EDTAD修飾Oxdc，使其有效吸附于一水草酸鈣上，并維持酶催化降解草酸鈣的能力是可行的。

圖11 Oxdc和EDTAD-Oxdc在一水草酸鈣上的吸附比較

3 結(jié) 論

本研究采用EDTAD對(duì)Oxdc進(jìn)行了化學(xué)修飾，初步優(yōu)化了修飾條件，分析了修飾后Oxdc的生物活性和結(jié)構(gòu)變化，并探討了酸酐修飾對(duì)部分酶學(xué)性質(zhì)及催化吸附性能的影響。結(jié)果表明，當(dāng)修飾反應(yīng)時(shí)間為8 h、EDTAD/Oxdc的摩爾比為50:1、反應(yīng)pH為7.0、反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，修飾率為71.91%，酶活回收率為75.42%。SDS-PAGE和UPLC-MS分析證明Oxdc和EDTAD成功共價(jià)結(jié)合，并表明EDTAD修飾Oxdc的位點(diǎn)位于Oxdc側(cè)鏈的自由氨基和N端的-氨基上。UV和CD分析結(jié)果表明修飾后Oxdc的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的改變。部分酶學(xué)性質(zhì)研究表明，經(jīng)EDTAD修飾后的Oxdc較游離的Oxdc，最適pH向堿性方向偏移了約1.5個(gè)單位，熱穩(wěn)定性和對(duì)胰蛋白酶的耐熱性均顯著增強(qiáng)。此外，在本實(shí)驗(yàn)條件下，修飾后的Oxdc在草酸鈣上的吸附量較未修飾的Oxdc約提高了42.42%。這些結(jié)果說(shuō)明Oxdc經(jīng)化學(xué)修飾引入酸酐，使其既可高效吸附固定于草酸鈣結(jié)晶上，又可發(fā)揮酶催化降解草酸促進(jìn)草酸鈣溶解的能力，從而改善應(yīng)用性能的方法是可行的。本實(shí)驗(yàn)為獲得緩解泌尿系草酸鈣結(jié)石病癥的酶制劑提供了理論參考。

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Chemical modification of oxalate decarboxylase with ethylenediaminetetraacetic dianhydride

HE Junbin1, LIN Rihui2, LONG Han1, WU Jia1, CAI Xinghua1, YANG Ying1, CHEN Shengfeng1

(1Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530007, Guangxi, China;2Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530007, Guangxi, China)

In order to improve the stability and application performance of oxalate decarboxylase (Oxdc) in the prevention and treatment of urinary calculi, chemical modification of Oxdc with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTAD) was investigated. The results of single-factor experiment showed that the extent of modification and the recovery rate of the enzymatic activity were 71.91% and 75.42%, respectively, when the reaction time was 8 h, the molar ratio of EDTAD/Oxdc was 50:1, pH 7.0, and the temperature was 37℃. The analysis results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS) indicated that Oxdc and EDTAD have been covalently bound. The ultraviolet-visible spectrum (UV) and circular dichroic (CD) measurement showed that the structure and conformation of Oxdc were tinily altered after modification by EDTAD. The enzymology changes of Oxdc were also analyzed, the results showed the optimum pH of EDTAD-modified Oxdc was shifted to the alkaline side about 1.5 unit and it had a higher thermostability. Moreover, through modification the adsorption capacity of Oxdc onto calcium oxalate monohydrate crystals was increased by 42.42%. These results suggested that the stability and application performance of Oxdc were significantly improved under this experiment.

urinary calculi; enzyme; oxalate decarboxylase; purification; ethylenediaminetetraacetic dianhydride; chemical modification; adsorption

2016-03-28.

Prof. LIN Rihui, rihuilin@aliyun.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20160355

Q 814; TQ 033

A

0438—1157（2016）10—4389—10

國(guó)家教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（教外司留[2012]1707號(hào)）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118045）；廣西民族大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（gxun-chxs2015089）。

2016-03-28收到初稿，2016-08-01收到修改稿。

聯(lián)系人：林日輝。第一作者：賀俊斌（1992—），男，碩士研究生。

supported by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education ([2012]1707), the Natural Science Foundation of Guangxi (2014GXNSFAA118045) and the Innovation Project of Guangxi University for Nationalities (gxun-chxs2015089).