化瘀祛濕方對早期膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞COX-2m RNA表達的影響

袁長深　梅其杰　秦　凱　段戡　曾明珠.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)：，廣西南寧500；.江西省上饒縣人民醫(yī)：，江西上饒400；.廣東省中醫(yī)：，廣東廣州500

化瘀祛濕方對早期膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞COX-2m RNA表達的影響

袁長深1梅其杰1秦凱2段戡1曾明珠3
1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)：，廣西南寧530023；2.江西省上饒縣人民醫(yī)：，江西上饒334100；3.廣東省中醫(yī)：，廣東廣州510120

目的通過觀察化瘀祛濕方對早期膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）患者滑膜成纖維細胞（FLS）中COX-2 mRNA表達的影響，闡釋化瘀祛濕方對早期KOA治療的作用機制。方法通過切斷膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，將成年健康新西蘭雄性大耳白兔16只造成KOA模型，并將其隨機分為生理鹽水組（A組）、補腎活血組（B組）、化瘀祛濕組（C組）、塞來昔布組（D組），造模成功后6周，連續(xù)喂藥7 d后處死實驗兔，靜脈穿刺采血，離心后取血清備用。將收集的早期KOA患者滑膜組織，經(jīng)分離、純化培養(yǎng)后，使用四代FLS用于實驗，依次分別加入含A、B、C、D組藥物的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復(fù)離心后，應(yīng)用RT-PCR檢測四組含藥血清干預(yù)后早期KOA患者FLS中COX-2mRNA的表達水平。結(jié)果早期KOA患者FLS經(jīng)不同含藥血清干預(yù)后均能檢測到COX-2 mRNA，A組的COX-2mRNA表達水平最高，與B、C、D組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；B組與C、D組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組與D組COX-2mRNA表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論化瘀祛濕方可有效抑制早期KOA患者FLS中COX-2mRNA的表達，在治療早期KOA中發(fā)揮重要作用。

膝骨關(guān)節(jié)炎；化瘀祛濕方；滑膜成纖維細胞；COX-2

1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530023，China；2.Shangrao People's Hospital，Jiangxi Province，Shangrao 334100，China；3.Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangdong Province，Guangdong Province，Guangzhou 510120，China

［Avsteact］Ov jective Through observing the effect of Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction for the expression of COX-2 mRNA of synovial fibroblasts（FLS）in patients with early knee osteoarthritis（KOA），to illustrate the mechanism of Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction for the treatment of early KOA. M ethods Through cutting off the anterior cruciate ligament and medial collateral ligament of knee joint，60 healthy adult New Zealandmale special rabbitswasmade into KOA models，and they were randomly divided into normal saline group（group A），nourishing kidney and activating blood group（group B），removing blood stasis and eliminating dampness group（group C），Celecoxib group（group D）.Aftermakingmodels successfully for 6 weeks，the experimental rabbits were put to death after continuousmedicine feeding for 7 d，collecting blood through venipuncture，the serum was taken as standby application after centrifugation.The collected synovial tissues of patients with early KOA were taken separation and purification culture，so as to be used in the experiment by the fourth generation of FLS，where were added into DMEM medium including the medicines of group A，B，C，D respectively.After repeated centrifugation，RT-PCR was used to detect the expression of COX-2 mRNA of FLS in the patients with early KOA after intervention bymedicated serum of the four groups.Results After intervention by differentmedicated serum for FLSof patientswith early KOA，COX-2 mRNA could be detected in all patients，the expression of COX-2 mRNA in group A was the highest，which had highly statistically significant differences compared with group B，C，D（P＜0.01）；group B had statistically significant differences compared with group C，D（P＜0.05）；the expression of COX-2mRNA between group C and group D had no statistically significant difference（P＞0.05）.Conclusion Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction can inhibit the expression of COX-2 mRNA of FLS in the patients with early KOA effectively，which plays an important role in the treatment of early KOA.

［Key woeds］Knee osteoarthritis；Removing Blood Stasis and Eliminating Dampness Decoction；Synovial fibroblasts；COX-2

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一組以關(guān)節(jié)軟骨病變?yōu)橹饕±硖卣鞯呐R床綜合征。在KOA病變過程中，滑膜的炎性介入是加速軟骨退變且誘發(fā)臨床癥狀的重要因素之一。采用化瘀祛濕方可有效抑制滑膜炎，緩解早期KOA的病情［1］。筆者在前期基礎(chǔ)上進一步觀察化瘀祛濕方對早期KOA滑膜成纖維細胞COX-2mRNA表達的影響，探討其可能的作用機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗分組

選擇成年健康新西蘭雄性大耳白兔16只（廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2014-0002，體重2.0～2.5 kg），并予編號，按隨機數(shù)字表法隨機抽取8只分成4組：生理鹽水組（A組）、補腎活血組（B組）、化瘀祛濕組（C組）、塞來昔布組（D組），每組2只。

1.2造模與處理

通過切斷膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶制造兔KOA軟骨退行性變動物模型，造模方法參照前期動物造模方法［1］。造模后使用甲硝唑、生理鹽水分別沖洗后予止血，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。術(shù)后肌注青霉素20萬U/（d·只），連續(xù)3 d。采用分籠標準飼養(yǎng)，自由活動。

1.3含藥血清備制

造模成功后6周，開始喂藥。按人和動物體表面積比計算動物等效給藥量［體表面積計算公式為Mech-Rubner公式：A=K×（W2/3）/1000，其中A為體表面積，以m2計算，W為體重，K為常數(shù)，計算后得出兔每日劑量為0.21 g/kg］，以實驗動物劑量的10倍進行灌胃，每天上午、下午各1次，間隔8 h，連續(xù)灌胃7 d。藥物組成與劑量：①化瘀祛濕方：丹參15 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、川牛膝10 g、蒼術(shù)15 g、半夏10 g、陳皮10 g、白術(shù)10 g；②補腎活血方：桑寄生15 g、補骨脂10 g、杜仲10 g、肉蓯蓉10 g、延胡索9 g、牛膝12 g。③塞來昔布膠囊0.2 g（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字J20050072）。為提高實驗結(jié)果的重復(fù)性，使用由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的單味中藥濃縮顆粒劑組配，并且要求同一批號。使用時拆開膠囊，按體表面積折算動物的等效劑量，再配成10 mL/d水溶液灌胃，連續(xù)給藥1周。正常兔以生理鹽水10 mL/d灌胃。在最后1次全天藥量灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）90 min后，麻醉（鹽酸氯胺酮注射液）下經(jīng)耳背中央動脈穿刺采血，4℃過夜，2500 r/min離心25min，取血清0.22μm濾膜抽濾、分裝，56℃、30min滅活、-20℃保存?zhèn)?。生理鹽水對照組灌以等量生理鹽水。

1.4滑膜準備

KOA早期滑膜組織均取自住：患者?；颊邽?0～70歲患者8例，病癥診斷符合以下診斷標準。經(jīng)膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)獲取病變滑膜組織。診斷標準：①西醫(yī)診斷標準：采用中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制訂的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》［2］（2007版）中的KOA診斷標準。②膝關(guān)節(jié)影像學(xué)診斷標準：參照Kellgren-Lawrence的分級標準［3］（早期：0～2級；晚期：3～4級）。③中醫(yī)證候診斷標準：參照鄭筱萸［4］主編的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（2002年修訂版）診斷標準。病例納入標準：①符合上述診斷標準；②年齡40～70歲；③病情X線分級屬0～Ⅱ級的患者；④基本了解試驗?zāi)康牟⒛芘浜媳局委煼桨刚?。排除標準：①重疊有其他風(fēng)濕性疾病者；②合并有嚴重的心血管、腦血管、肺、肝、腎和血液系統(tǒng)原發(fā)疾病及精神病患者；③2個月內(nèi)接受過激素治療者；④孕婦或哺乳期婦女；⑤不合作者。

1.5方法

1.5.1標本取材關(guān)節(jié)鏡下夾取滑膜組織，在無菌條件下立即置于預(yù)先盛有含青霉素200 kU/L、鏈霉素200 mg/L的D-Hank液中浸泡并漂洗3遍，減少污染機會，24 h內(nèi)分離培養(yǎng)。

1.5.2成纖維樣滑膜細胞（FLS）原代培養(yǎng)FLS原代培養(yǎng)采用不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)，根據(jù)筆者前期實驗步驟進行培養(yǎng)［2］。

1.5.3FLS的傳代培養(yǎng)FLS的傳代培養(yǎng)根據(jù)筆者前期實驗步驟進行培養(yǎng)［5］，直至培養(yǎng)第Ⅳ代細胞。

1.5.4含藥血清對滑膜細胞的干預(yù)取第Ⅳ代細胞以1×105/mL傳代接種于培養(yǎng)瓶中，分成4組，分別加入含生理鹽水、補腎活血方、化瘀祛濕方、塞來昔布含藥血清的DMEM培養(yǎng)基（自Gibico公司），連續(xù)培養(yǎng)24 h。重復(fù)離心后，收集上清，-20℃凍存待測。

1.5.5FLS細胞總RNA的提?、偻娣e貼壁細胞加入Trizol 1mL，充分振蕩；②加入氯仿0.2mL，充分振蕩，孵育、離心后取1.5 mL致Eppendorf管；③加與上清液等體積的異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)5次搖勻，-20℃孵育樣品20min，4℃12 000 r/min離心10min，吸去上清液；④加75%乙醇（含DEPC水）800μL洗滌沉淀1次，4℃7500 r/min離心5 min，吸棄乙醇；⑤在空氣或真空干燥5～10min（不要完全干燥），再加DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。若長期保存，加入2.5倍體積乙醇，置-80℃保存。

1.5.6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)①RNA短暫離心；②將11μL的DEPC水和RNA（1μg）放入EP管內(nèi)，置于冰上，使RNA終濃度為0.5μg/μL，再加入Oligo（dt）1μL，輕輕混合均勻，短時間離心（RNA=1/總RNA濃度=1/ OD260×6，DEPC水=11-RNA）；③依次加入4μL的5×buffer，1μL的核糖核苷酸酶抑制劑，2μL的10 mm dNTPMIXTURE，1μL的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶后輕輕混合均勻，短時間內(nèi)離心；④將混合物置于42℃，60 min。70℃加熱5 min，中止上述反應(yīng)，置于冰上。

1.5.7實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測RT-PCR引物由PrimerPremier6.0設(shè)計引物，Oligo7評估引物，最后由上海生工合成引物（表1）。按SYBR Green染料法熒光定量RT-PCR檢測：為最大程度保證實驗結(jié)果，在打開之前將其融解，并于微型離心機上輕微離心；準備100×濃度的PCR引物溶液（30μmol/L）；將反應(yīng)管置于冰上，在50-μL的單個PCR反應(yīng)體系中，依次加入Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）、正向引物（30μmol/L）、反向引物（30μmol/L）、水、PCR等級cDNA反應(yīng)液組分；并按程序運行PCR儀（圖1）。反應(yīng)結(jié)束后確認RT-PCR的擴增曲線和融解曲線。

表1　引物序列及相關(guān)信息

圖1　PCR程序運行

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1擴增曲線分析

在擴增曲線上的線性增長期，分析生成相應(yīng)的標準曲線圖（圖2）。根據(jù)標準曲線的斜率與擴增效率之間的關(guān)系，算出特異性內(nèi)參序列和目的基因的擴增效率分別為95.7%和97.9%，此數(shù)值在PCR擴增效率90%～110%范圍內(nèi)，即可認為該標準曲線是可靠的。實驗以β-actin為內(nèi)參做校正，與配對的對照組（生理鹽水組）相比，所有實驗組的FLSCOX-2 mRNA的相對表達量呈低表達水平（圖3）。

圖2　內(nèi)參基因與目的基因的擴增曲線

圖3　茁-actin和COX-2 mRNA標準曲線

2.2PCR擴增過程中的熔解曲線分析

SYBR Green是一種在PCR擴增中不顯示特異性的DNA雙鏈結(jié)合染料，可通過觀察熔解曲線是否有出現(xiàn)非特異性條帶判斷其特異性。本實驗中可看出的熔解曲線見圖4。

圖4　內(nèi)參基因與目的基因的熔解曲線

2.3應(yīng)用2-ΔΔCt進行相對表達量的分析

比較各組間早期KOA患者FLS中的COX-2 mRNA表達量，A組要明顯高于B、C、D三組（P＜0.01）；在實驗組間，B組約是D組的3倍（P＜0.05）、C組的2倍（P＜0.05），C組與D組兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表2。

圖5　COX-2 m RNA的相對表達量

表2　A組患者和不同含藥血清組KOA患者FLS COX-2 m RNA的CT值比較

2.4RT-PCR電泳圖

在本研究中，為進一步明確RT-PCR擴增產(chǎn)物的特異性，以COX-2基因cDNA為模板進行普通PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖，結(jié)果可見大小約190 bp的單一條帶，未見有雜帶及產(chǎn)物二聚體。見圖6。

圖6　COX-2 RT-PCR產(chǎn)物和茁-actin RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

滑膜增生和炎癥是KOA的重要組成部分和重要特征之一。在KOA早期，滑膜的增生和纖維化，分泌炎癥介質(zhì)和軟骨降解酶，可能是KOA發(fā)病的重要因素，且參與其整個病理過程［6］，從滑膜治療KOA將成為一個新的研究方向［7］。

滑膜炎癥是關(guān)節(jié)內(nèi)局限性炎癥病因所在［8］。在癥狀性KOA患者中不僅存在滑膜增厚現(xiàn)象，而且與關(guān)節(jié)疼痛程度呈正相關(guān)［9］；而在有炎癥的KOA滑膜組織中，滑膜分泌的炎性介質(zhì)程度與滑膜組織的層次相關(guān)［10］，特別是髕下脂肪墊滑膜炎癥，過度表達的一些炎癥介質(zhì)、細胞因子等［11］，不僅加重關(guān)節(jié)癥狀（腫脹、疼痛、積液等），而且加速KOA進展。因此，將炎癥滑膜作為治療KOA的藥物靶點［12］，有助于抑制滑膜病變，減少滑膜的炎癥，延緩原發(fā)性KOA的進展［13］。

在KOA的FLS中，可產(chǎn)生大量的炎性細胞因子及免疫反應(yīng)介質(zhì)，且COX-2 mRNA高表達［4］。由于COX-2 mRNA表達且與炎癥和疼痛有關(guān)，那么，對COX-2的抑制作用越強，抗炎作用就越強［14］。通過抑制COX-2的表達，可減少其誘導(dǎo)產(chǎn)物前列腺素的合成，有效緩解關(guān)節(jié)炎癥，減輕關(guān)節(jié)疼痛等［15］，有效抑制滑膜組織中COX-2的表達，將是治療KOA的重要環(huán)節(jié)。

為了探索滑膜組織在OA病程中的作用機制，從滑膜炎癥的主體——FLS入手，通過對FLS進行原代培養(yǎng)，觀察COX-2 mRNA的表達對KOA的影響。在本研究中，采用RT-PCR方法測定早期KOA患者體外培養(yǎng)FLS中COX-2mRNA表達，結(jié)果顯示COX-2 mRNA有較高水平的表達，與前期研結(jié)果相符［5］，表明COX-2在早期KOA中起到重要作用（實驗組與A組比較P＜0.01）（圖3）。

雖然KOA病機、證候復(fù)雜，但早期或急性發(fā)作期以瘀濕為主，專行“化瘀、祛濕”，方能奏效［16］；而類似的治療方法亦取得了較好的效果［17-20］。

在采用2-ΔΔCt進行相對表達量的分析中，A組的COX-2 mRNA表達水平最高，與D、C組及B組比較有明顯差異（P＜0.05）。而在本研究中，由于活血化瘀類藥物可通過改善局部微循環(huán)，減輕滑膜水腫，緩解關(guān)節(jié)內(nèi)高壓，直接或間接消除關(guān)節(jié)內(nèi)局限性炎癥，所以補腎活血方對早期KOA中FLS的COX-2 mRNA表達有一定的抑制作用（B組與A組比較P＜0.01），但其作用甚微。針對“血瘀、痰濕”的病機，采用化瘀祛濕方處理，其效果與塞來昔布類似（P＞0.05），可能與此方通過干預(yù)早期KOA誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）炎癥途徑發(fā)揮作用相關(guān)［1］，通過抑制滑膜中iNOS的表達，減少iNOS與COX-2結(jié)合，降低合成NO，減弱NO對COX-2的修飾作用［21］。通過抑制COX-2mRNA的表達，可有效降低前列腺素的合成，可能與調(diào)節(jié)COX-2 mRNA的表達水平發(fā)揮COX-2抑制劑樣作用相關(guān)。

化瘀祛濕方通過抑制早期KOA患者FLS中COX-2 mRNA表達水平，在治療早期KOA作用機制中發(fā)揮重要作用。

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Effect of Removing Blood Stasis and Elim inating Dam pness Decoction foe the expeession of COX-2 m RNA of synovial fiveov lasts in eaely knee osteoaetheitis

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1674-4721（2016）08（c）-0040-06

2016-04-15本文編輯：張瑜杰）

廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥自籌經(jīng)費科研課題（GZZC14-17）。

，長深（1978-），男，碩士研究生，主要從事骨與關(guān)節(jié)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，擅長骨與關(guān)節(jié)疾病的中西醫(yī)治療。

段戡（1964-），男，博士研究生，主任醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)疾病的防治，擅長髖膝關(guān)節(jié)疾病的治療。