IMRT、VMAT模式照射離體人肺癌細胞的生物學效應研究

董俊林　趙　靜　朱定清　王思陽　龔五星　李小亮　張振林.廣東省珠海市人民醫(yī)：，廣東珠海59000；.澳門大學，澳門999078；.中山大學第五附屬醫(yī)：，廣東珠海59000

IMRT、VMAT模式照射離體人肺癌細胞的生物學效應研究

董俊林1趙靜2朱定清1王思陽3龔五星1李小亮1張振林1
1.廣東省珠海市人民醫(yī)：，廣東珠海519000；2.澳門大學，澳門999078；3.中山大學第五附屬醫(yī)：，廣東珠海519000

目的觀察調(diào)強適形放射治療（IMRT）、容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放射治療（VMAT）模式照射離體人肺癌細胞的生物效應，研究IMRT、VMAT模式放療照射的作用機制，為制訂合理的臨床放療方案提供理論依據(jù)。方法選取人肺鱗癌細胞SK-MES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446，分別進行體外瓊脂懸浮克隆培養(yǎng)法建立腫瘤模型。分別使用9個不同的照射劑量點進行急速照射研究，照射3min后計算細胞存活分數(shù)，采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)線性二次方程擬合細胞存活曲線，再把呈指數(shù)生長期的SK-MES-1、NCI-H446分別分成四個組：①VMAT模式照射組（直線型加速器能量為6 MV 6min照射）；IMRT模式15min照射組；IMRT模式30min照射組；IMRT模式45min照射組。每組照射總量為8 Gy，1次/d，2 Gy/次，4 d內(nèi)完成。最后，采用克隆分析法計算細胞的存活分數(shù)，對比IMRT模式和VMAT模式的放射特點及生物效應。結(jié)果①急速照射完成后，分析得到SK-MES-1、NCI-H446細胞的放射生物學參數(shù)。SK-MES-1細胞各參數(shù)詳細數(shù)值分別為（D0、Dq、N值、α值、β值、α/β值）：0.87 Gy、0.48 Gy、3.6、0.17 Gy-1、0.091 Gy-2、1.87 Gy；NCI-H446細胞以上各參數(shù)數(shù)值分別為0.61 Gy、0.35 Gy、4.0、0.98 Gy-1、0.089 Gy-2、11.01 Gy。②總量為8 Gy的4 d照射中，SK-MES-1細胞各照射組（VMAT模式照射組和IMRT模式15、30、45min照射組）的細胞存活率分別為7.25%、8.95%、9.63%、11.32%，IMRT模式照射下的細胞存活率較VMAT模式明顯增加。NCI-H446細胞以上各組照射后的細胞存活率分別為0.192%、0.205%、0.208%、0.209%，差異不明顯。結(jié)論人肺鱗癌細胞SK-MES-1的細胞放射敏感性（D0、N值）相對人肺小細胞癌細胞NCI-H446更低，亞致死性損傷修復能力（Dq值和α/β值）相對NCI-H446細胞更強，劑量率改變對其放射生物效應影響明顯，IMRT模式單次劑量輸出時間延長導致SK-MES-1細胞生存率增加，NCI-H446細胞增加不明顯。

人肺癌細胞；調(diào)強適形放射治療；容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放射治療；生物效應

1.Zhuhai People's Hospital，Guangdong Province，Zhuhai 519000，China；2.University of Macau，Macau 999078，China；3.the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangdong Province，Zhuhai 519000，China

［Avsteact］Ovjective To observe the biological effects of intensity-modulated radiotherapy（IMRT）and volumetric modulated arc therapy（VMAT）irradiation for the human lung cancer cells in vitTo，and to study the mechanism of IMRT and VMAT irradiation，in order to provide evidence for formulating reasonable clinical radiotherapy plan. M ethods The human lung squamous carcinoma cells SK-MES-1 and human lung small cell cancer cells NCI-H446 were selected to establish tumor model by agar suspension culture method in vitTo，then the cells were given rapid radiation research at 9 dose levels.After irradiation for 3 min，the survival percentage of cells was calculated，GraphPad Prism software was used to process data，the cell survival curve was fitwith linear-quadratic formula，then the SK-MES-1，NCI-H446 at exponential growth phase were divided into four groups：VMAT irradiation group（the energy of linear accelerator was 6 MV，for 6 min）；IMRT irradiation for 15 min group；IMRT irradiation for 30 min group；IMRT irradiation for 45 min group.The total irradiation of each group was 8 Gy，once a day，2 Gy every time，finished in 4 days.At last，the cloning assay was used to calculate the survival rate of cells，to compare the radiation characteristics and biological effects between IMRT model and VMATmodel.Results①After finishing rapid radiation，the radiobiological parameters ofSK-MES-1，NCI-H446 cellswere achieved.The detailed numerical value of each parameter of SK-MES-1 cells（D0，Dq，N value，αvalue，βvalue，α/βvalue）was 0.87 Gy，0.48 Gy，3.6，0.17 Gy-1，0.091 Gy-2，1.87 Gy respectively；which of NCI-H446 cells was 0.61 Gy，0.35 Gy，4.0，0.98 Gy-1，0.089 Gy-2，11.01 Gy respectively.②In the irradiation of 4 d with 8 Gy，the survival rate of SK-MES-1 cells in all groups（VMAT irradiation group and IMRT irradiation for 15，30，45min group）was 7.25%，8.95%，9.63%，11.32%respectively，the survival rate under the IMRT irradiation was higher than that of VMAT irradiation.The survival rate of NCI-H446 cells in the groups above was 0.192%，0.205%，0.208%，0.209%respectively，the difference was not obvious.Conclusion The cellular radiosensitivity（D0，N value）of human lung squamous carcinoma cells SK-MES-1 is lower than that of human lung small cell cancer cells NCI-H446，the sublethal damage repair capacity（Dq value andα/βvalue）is stronger than that of NCI-H446，the changes of dosage rates has significant influence for the radiobiological effect，the prolonged single dose output time of IMRTmodel lead to the increase the survival rate of SK-MES-1 cells，without obvious increase in NCI-H446 cells.

［Key woeds］Human lung cancer cells；Intensity-modulated radiotherapy；Volumetricmodulated arc therapy；Biological effects

肺癌（1ung cancer）的發(fā)病率及死亡率呈不斷上升趨勢，在20世紀末已成為各種癌癥死亡的首要原因，對人類健康的威脅越來越嚴重［1］。大部分肺癌患者確診時已經(jīng)處于中晚期或晚期，不可以接受手術(shù)治療，只能選擇以放射治療為主的綜合治療模式［2-3］。因此，研究尋找非小細胞肺癌患者出現(xiàn)放射抗拒性的規(guī)律，尋找放射增敏的方法是提高治愈率的途徑之一。而肺癌細胞的生物學效應變化情況對于疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸有積極的反應價值［4-5］，因此對人肺癌細胞的生物效應進行變化觀察的價值較高，尤其是對于不同放療方式對肺癌細胞的影響情況研究極為必要，因此本研究針對肺癌細胞在離體狀體下進行調(diào)強適形放射治療（intensitymodulated radiotherapy，IMRT）、容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放射治療（volumetric modulated arc therapy，VMAT）模式照射的生物效應進行研究。

1　對象與方法

1.1對象

本研究采用臨床常見腫瘤人肺鱗癌細胞SKMES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446，因鱗癌和小細胞肺癌對于放射治療的敏感度相對好于腺癌，因此在研究中應選取此類癌細胞進行研究，將其分別進行體外實驗，研究模擬調(diào)強放療技術(shù)的照射時間及照射劑量對放射生物效應的影響。所用人肺鱗癌細胞SKMES-1購自中國科學：上海細胞庫，人肺小細胞癌細胞NCI-H446由中山大學實驗動物中心提供。

1.2設計和分組

實驗采用指數(shù)生長期細胞進行，共分為兩個部分：急速照射-確定細胞放射生物學參數(shù)；常規(guī)照射效應分析（IMRT模式照射組和VMAT模式照射組），研究模擬調(diào)強放療技術(shù)的照射時間及照射劑量對放射生物效應的影響。進行常規(guī)照射效應分析時，把呈指數(shù)生長期的SK-MES-1、NCI-H446細胞分別分成四個組：①VMAT模式照射組（直線型加速器設定能量為6 MV 6 min照射）；②IMRT模式15 min照射組；③IMRT模式30 min照射組；④IMRT模式45 min照射組。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)方法［4］將人肺鱗癌細胞SK-MES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446培養(yǎng)于PRMI-1640培養(yǎng)基中。PRMI-1640培養(yǎng)基由10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素組成。培養(yǎng)時，將以上兩種人肺癌細胞制成單細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)時，保證細胞貼壁生長均勻，以確保細胞能夠營養(yǎng)均勻，同步生長。

1.3.2獲得細胞放射生物學參數(shù)［4-5］把人肺鱗癌細胞SK-MES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446按各劑量點要求接種，10 h內(nèi)對四種人肺癌細胞分別進行9個劑量點的急速照射（包括0、0.4、0.6、1、2、4、6、8、10 Gy共9個劑量點），照射持續(xù)時間為3min。然后分別對SK-MES-1、NCI-H446細胞進行離體IMRT、VMAT模式照射。模擬IMRT照射共分為三組進行，即IMRT模式15、30、45 min照射組，各組所含照射劑量點同于急速照射組，每個劑量點分7次照射，其間分別為2.5、5、7.5 min，照射完成總時間分別15、30、45min。IMRT模式照射采用西門子醫(yī)用直線加速器的6 MV射線照射，劑量率為3.6 Gy/min。VMAT模式照射采用6 MV直線加速器持續(xù)照射。SK-MES-1細胞接種細胞數(shù)5×103個，NCI-H446細胞接種細胞數(shù)105個。各組每天照射1次，每次給予2 Gy的放射治療，持續(xù)治療4 d。放射治療結(jié)束后，根據(jù)克隆分析法計算細胞的存活分數(shù)，對比IMRT模式和VMAT模式的細胞生物學特點。

1.3.3采用克隆分析法計算細胞的存活分數(shù)［4］克隆形成實驗：照射結(jié)束后將所有細胞置于37℃、含5% CO2氣體的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。10 d后除去培養(yǎng)液，用無水乙醇固定細胞后使用Giemsa液對細胞核染色。染色后將殘留的Giemsa液沖洗干凈；顯微鏡下計算細胞存活數(shù)。細胞存活數(shù)只計算＞50個的細胞的克隆數(shù)作為存活細胞。另外克隆率=集落形成數(shù)/接種細胞數(shù)。

1.4觀察指標

采用GRAPHPAD Prism 4.0軟件進行檢驗分析，根據(jù)線性二次方程（LQ）模式擬合細胞存活線，并計算LQ模型［S=exp（-αD-βD2）］，不完全修復模型［S= exp（-αD-βgD2）］（D0=1/K）［4，6］。分別求出肺癌細胞的D0、Dq、α、β、α/β。

離體細胞照射試驗中，細胞存活率（SF）可表示放射生物效應（SF=1/α）；D0反映了細胞對高劑量放射治療的敏感性，敏感性與D0值的大小成正比；準閾劑量Dq表示細胞亞致死性修復能力，修復能力的強弱與Dq值的大小成正比；外推數(shù)N反映細胞內(nèi)所含放射敏感區(qū)域數(shù)，其是存活曲線直線部分的延長線與縱軸相交處的數(shù)值。線性二次方程中，參數(shù)α決定低劑量下?lián)p傷的程度，系數(shù)β反映亞致死性損傷修復能力。

2　結(jié)果

2.1不同照射劑量下SK-MES-1及NCI-H 446細胞克隆形成率及百分存活率

相同的照射條件下，人肺鱗癌細胞SK-MES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446細胞克隆形成率及存活率與照射劑量之間的關系顯示，隨著照射劑量的升高，克隆形成率及存活率均降低。見表1。

表1　SK-MES-1堯NCI-H446細胞克隆形成率及細胞存活率（%，x±s）

2.2SK-MES-1、NCI-H 446細胞單靶多擊數(shù)學模型擬合結(jié)果及LQ模型擬合結(jié)果

細胞單靶多擊數(shù)學模型及LQ模型擬合結(jié)果分析，SK-MES-1細胞D0值為0.87 Gy，Dq值為0.48 Gy，N值為3.6；NCI-H446細胞D0值為0.61 Gy，Dq值為0.35 Gy，N值為4.0。以LQ模型擬合，得出SK-MES-1細胞α值為0.17 Gy-1，β值為0.091 Gy-2，α/β值為1.87 Gy；NCI-H446細胞α值為0.98 Gy-1，β值為0.089 Gy-2，α/β值為11.01 Gy。

2.3IMRT、VMAT模式照射下K-MES-1、NCIH 446細胞存活率

SK-MES-1細胞VMAT組細胞存活率為7.25%，IMRT模式15、30、45 min照射組細胞存活率高于VMAT模式照射組。NCI-H446細胞VMAT模式照射組細胞存活率為0.192%，IMRT模式15、30、45 min照射組細胞存活率與VMAT組比較差異不明顯。見表2。

表2　SK-MES-1堯NCI-H446細胞分別在IMRT堯VMAT模式照射下的存活率（%）

3　討論

放射治療的主要目的是在保護正常組織的前提下，提高腫瘤區(qū)域的放射線劑量，最大限度地殺死癌細胞，提高放射治療的治療增益比［7］。IMRT［8-9］是根據(jù)腫瘤靶區(qū)的形狀調(diào)整照射視野的形狀及視野內(nèi)的照射劑量，使得照射視野的形狀與腫瘤靶區(qū)的形狀盡可能一致，保證靶區(qū)內(nèi)及表面的照射劑量均勻相等。VMAT［10］是在IMRT的基礎上，不斷改良照射技術(shù)，研發(fā)得到的一種可以在較短時間內(nèi)完成IMRT同等照射劑量的一種新型放射治療方法。本研究選用人肺鱗癌細胞SK-MES-1、人肺小細胞癌細胞NCI-H446，分別進行體外實驗，研究IMRT模式照射時間及照射劑量對放射生物效應的影響，并與VMAT模式進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究中的SK-MES-1、NCI-H446細胞在0.4、0.6 Gy兩個劑量點都沒有發(fā)現(xiàn)低劑量時的超敏現(xiàn)象；同時，總劑量升至10 Gy后，生物效應亦無提高。比較SK-MES-1、NCI-H446細胞的生物學參數(shù)，結(jié)果表明SK-MES-1細胞的細胞放射敏感性（D0、N值）相對NCI-H446細胞低，亞致死性損傷修復能力（Dq值和α/β值）相對NCI-H446細胞更強。人肺鱗癌細胞SK-MES-1生存率隨著IMRT模式單次劑量輸出時間延長（15、30、45 min）逐漸增加，而NCI-H446細胞增加不明顯。較之IMRT模式，VMAT組細胞生存率更低。說明，在照射總劑量相同的條件下，隨著各組IMRT模式單次劑量照射時間的不斷延長（15、30、45 min），照射之間的間歇次數(shù)增加，照射相對劑量率逐漸降低［4］，使得SK-MES-1生存率不斷增加，從而降低放射生物效應和放射療效；與SK-MES-1細胞相比，NCI-H446細胞的分化程度較低，IMRT模式照射時間的延長對其放射療效無明顯影響。VMAT單次照射的時間較短，從而增加單位時間內(nèi)的劑量率，提高放射治療的增益比［11-13］。本研究提示，VMAT模式照射比IMRT模式更加具有優(yōu)勢，殺死更多的癌細胞，對正常組織的放射損傷更低。從最優(yōu)化理論的角度來看，放射治療計劃應該在提高腫瘤局部控制率的同時充分考慮正常組織的耐受劑量［14-16］，盡可能降低發(fā)生正常組織并發(fā)癥的概率［17-20］。

綜上所述，人肺鱗癌細胞SK-MES-1的細胞放射敏感性（D0、N值）相對人肺小細胞癌細胞NCI-H446低，亞致死性損傷修復能力（Dq值和α/β值）相對NCI-H446細胞更強，劑量率改變對其放射生物效應影響明顯，IMRT模式單次劑量輸出時間延長導致SK-MES-1細胞生存率增加，NCI-H446細胞增加不明顯。

［1］陳萬青，張思維，曾紅梅，等.中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡［J］.中國腫瘤，2014，23（1）：1-10.

［2］SiegelR，Naishadham D，JemalA.Cancer statistics，2013［J］. CA：a cancer journal for clinicians，2013，63（1）：11-30.

［3］殷蔚伯.腫瘤放射治療學［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2008：240-245.

［4］王志，鄔蒙，何秀琴，等.鼻咽癌CNE1、CNE2細胞系IMRT模式離體照射生物效應研究［J］.實用癌癥雜志，2008，23（3）：248-251.

［5］姜玲，熊曉鵬，胡超蘇，等.照射實施時間延長對腫瘤細胞殺滅效應影響的體外實驗研究［J］.中國癌癥雜志，2009，19（2）：112-117.

［6］張春，潘建基，張瑜，等.鼻咽癌適形調(diào)強放療對腮腺功能影響的前瞻性研究［J］.實用癌癥雜志，2007，22（4）：380.

［7］Otto K.Volumetric modulated arc therapy：IMRT in a single gantry arc［J］.Medical Physics，2008，35（1）：310.

［8］Vieillot S，Azria D，Lemanski C，et al.Plan comparison of volumetric-modulated arc therapy（RapidArc）and conventional intensity-modulated radiation therapy（IMRT）in anal canal cancer［J］.Radiat Oncol，2010，5（8）：1984-1990.

［9］Shang J，Kong W，Wang YY，et al.VMAT planning study in rectal cancer patients［J］.Radiat Oncol，2014，9（1）：219.

［10］van GijnW，Marijnen CA，Nagtegaal ID，etal.Preoperative radiotherapy combined with totalmesorectal excision for resectable rectal cancer：12-year follow-up of the multicentre，randomised controlled TME trial［J］.Lancet Oncol，2011，12（6）：575-582.

［11］張矛，金海國，卜明偉，等.腦膠質(zhì)瘤術(shù)后VMAT與IMRT放療技術(shù)間比較［J］.中國醫(yī)學物理學雜志，2011，28（6）：2959-2963.

［12］張瑞，習勉，李巧巧，等.胸上段食管癌容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強和靜態(tài)調(diào)強與三維適形放療計劃的劑量學比較［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2012，33（2）：260-264.

［13］商海焦，陳利，王學濤，等.鼻咽癌CDR-VMAT與ss-IMRT劑量學比較評估［J］.中國醫(yī)學物理學雜志，2014，31（1）：4612-4616.

［14］遲鋒，溫戈，陳利，等.直腸癌術(shù)前三維適形和五野及容積弧形調(diào)強放療劑量學比較［J］.中華腫瘤防治雜志，2014，21（18）：1455-1460.

［15］郭蕊，孫穎，黃劭敏，等.鼻咽癌容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放療與常規(guī)靜態(tài)調(diào)強放療的劑量學對比研究［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2012，33（6）：835-840，855.

［16］張黎，習勉，孫文釗，等.肝癌三維適形、靜態(tài)調(diào)強與容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強放射治療的劑量學研究［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2012，33（3）：402-406.

［17］張耀文，鄭安平，董尚文，等.胸上段食管癌容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強與靜態(tài)調(diào)強放療計劃的劑量學比較［J］.中華腫瘤防治雜志，2014，21（23）：1902-1906，1910.

［18］易金玲，金獻測，周永強，等.鼻咽癌IMRT與VMAT治療的計劃與劑量驗證比較研究［J］.中國醫(yī)學物理學雜志，2013，30（1）：3859-3865.

［19］徐莉霞，李夏東，章霓，等.胃癌術(shù)后IMRT和VMAT計劃的劑量學比較［J］.實用腫瘤雜志，2015，30（2）：154-156.

［20］蔣軍.容積弧形調(diào)強放療、固定野調(diào)強放療與三維適形放療在局部晚期非小細胞肺癌中的劑量學對比研究［D］.蘇州：蘇州大學，2014.

Study on the viological effects of IMRT and VMAT ieeadiation foe the human lung cancee cells in vitro

DONG Junlin1ZHAO Jing2ZHU Dingqing1WANG Siyang3GONGWuxing1LIXiaoliang1ZHANG Zhenlin1

R734.2

A

1674-4721（2016）08（c）-0036-04

2016-04-28本文編輯：張瑜杰）

廣東省珠海市科技計劃項目（2014130）。

董俊林（1961.8-），男，碩士研究生，副主任醫(yī)師；研究方向：腫瘤放射治療。