淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量評(píng)價(jià)

王春娥　盧　旭　石繼春　劉茹鳳　李　紅　陳　瓊　唐　靜　陳翠萍　葉　強(qiáng)中國(guó)食品藥品檢定研究：衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量評(píng)價(jià)

王春娥盧旭石繼春劉茹鳳李紅陳瓊唐靜陳翠萍葉強(qiáng)
中國(guó)食品藥品檢定研究：衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

目的對(duì)12種淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法應(yīng)用12種淋球菌PCR試劑盒質(zhì)控參考品，按照各試劑盒說明書的方法提取模板及核酸擴(kuò)增，檢測(cè)各試劑盒的陽(yáng)性參考品符合率、陰性參考品符合率、批內(nèi)精密度及最低檢測(cè)限，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果12種試劑盒的陽(yáng)性參考品符合率及陰性參考品符合率均為100%；批內(nèi)精密度：各試劑盒檢測(cè)結(jié)果Ct值的變異系數(shù)均小于5.0%；12種試劑盒中有10種試劑盒的最低檢出限能達(dá)到1×103個(gè)菌/mL，其中3種能達(dá)到1×102個(gè)菌/mL，但另外2種試劑盒的最低檢出限僅達(dá)到1×104個(gè)菌/mL。結(jié)論12種淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒質(zhì)量均較好，性能可靠。

淋球菌；試劑盒；國(guó)家參考品；實(shí)時(shí)PCR

［Avsteact］Ov jective To evaluate twelve PCR kits for detection of Neisseria gonorrhea.M ethods Twelve kinds of Neisseria gonorrhoeae PCR kitwere selected，the templates extract and nucleic acid amplification of the quality control reference were conducted according to the kit introduction.The coincidence rates of positive and negative reference，the within-run precision and the lowest detection limit of the kits were detected according the national reference panel of Neisseria gonorrhea and were comparatively analyzed.Results The coincidence rates of positive reference and negative reference of all kits were 100%，and the CV of test results for precision was all less than 5.0%.The lowest detection limit of 10 kits was 1×103bacteria/mL，and 3 kits was 1×102bacteria/mL among them.But the CV of the other 2 kits was only 1×104bacteria/mL.Conclusion The twelve PCR kits for Neisseria gonorrhea are reliable.

［Key woeds］Neisseria gonorrhea；Kit；National reference panel；Real-time PCR

淋球菌?？梢鹑祟惷谀蛏诚到y(tǒng)化膿性感染，俗稱淋病。淋病是我國(guó)發(fā)病率較高的性傳播疾病之一，及早發(fā)現(xiàn)和有效治療是控制淋球菌感染的有效方式［1-2］。目前用于淋球菌的檢測(cè)方法很多，如涂片法、培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)法［3］、酶法［4］、核酸檢測(cè)法等。近年來淋球菌的核酸檢測(cè)以其快速、靈敏成為主流方法［5-6］，目前國(guó)內(nèi)已有17家企業(yè)的淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、7家企業(yè)的淋球菌、解脲脲原體、沙眼衣原體二聯(lián)或三聯(lián)核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，尚有多家企業(yè)申報(bào)注冊(cè)。本實(shí)驗(yàn)使用淋病PCR試劑盒質(zhì)控參考品，對(duì)8家企業(yè)已上市的9種試劑盒及2015～2016年3家企業(yè)在中國(guó)食品藥品檢定研究：（以下簡(jiǎn)稱“中檢：”）申報(bào)注冊(cè)的淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)。

員對(duì)象與方法

1.1淋病PCR試劑盒質(zhì)控參考品

參考品由中檢：呼吸道細(xì)菌疫苗室制備，包括10份陽(yáng)性參考品（NG-P1～NG-P10）、10份陰性參考品（NG-N1～NG-N10）、5份精密度參考品（NG-R）和1份最低檢出限參考品（NG-S），共計(jì)26份，批號(hào)：210015-201511。

1.2試劑與儀器

試劑盒A～I(xiàn)為已上市銷售的8家企業(yè)的9種不同的淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），試劑盒J、K、L為2015～2016年在中檢：申請(qǐng)注冊(cè)檢驗(yàn)的來自3家企業(yè)的試劑盒，其中試劑盒K為沙眼衣原體/淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）。QIAamp DNA Mini Kit（NO.51304）購(gòu)自QIAGEN公司；7500熒光定量PCR儀（ABI7500）為ABI公司產(chǎn)品；全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（GeneXpertDx）為Cepheid公司產(chǎn)品。

1.3方法

按照各試劑盒的產(chǎn)品說明書對(duì)參考品進(jìn)行處理，提取DNA。將陽(yáng)性參考品、陰性參考品處理后按照各試劑盒擴(kuò)增條件分別進(jìn)行PCR。將精密度參考品分10次提取核酸模板，分別經(jīng)10次PCR擴(kuò)增，計(jì)算批內(nèi)Ct值的變異系數(shù)（CV）。將最低檢出限參考品NGS進(jìn)行10倍系列稀釋3個(gè)稀釋度，濃度分別為1× 104、1×103、1×102個(gè)菌/mL，標(biāo)記為S4、S3、S2，分別提取模板進(jìn)行PCR。若試劑盒中不含DNA提取試劑或者對(duì)提取試劑未作特殊說明，則采用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit提取DNA。根據(jù)各試劑盒的說明書，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

2　結(jié)果

2.1陽(yáng)性參考品符合率

采用10份淋球菌陽(yáng)性參考品對(duì)12種試劑盒的18批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，各試劑盒的陽(yáng)性參考品符合率均為100%，符合參考品的檢測(cè)要求。見表1。

2.2陰性參考品符合率

采用10份淋球菌陰性參考品對(duì)12種試劑盒的18批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，各試劑盒的陰性參考品符合率均為100%，符合參考品的檢測(cè)要求。見表1。

2.3批內(nèi)精密度

采用精密度參考品對(duì)12種試劑盒的18批次樣品的批內(nèi)精密度分別進(jìn)行檢測(cè)，其目的基因檢測(cè)通道Ct值為13.22～30.00，CV值為0.3%～4.6%，均低于5.0%。見表1。

表1　不同試劑盒的陽(yáng)性參考品堯陰性參考品堯精密度參考品檢測(cè)結(jié)果

2.4最低檢出限

采用系列梯度稀釋的最低檢出限參考品對(duì)不同企業(yè)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同試劑盒的最低檢出限有所不同，12種試劑盒中有10種試劑盒的最低檢出限能達(dá)到1×103個(gè)菌/mL，其中試劑盒D、J、K的最低檢出限可達(dá)到1×102個(gè)菌/mL。但另外2種試劑盒（試劑盒I、L）的最低檢出限僅達(dá)到1×104個(gè)菌/mL。見表2。

表2　不同試劑盒的最低檢出限檢測(cè)結(jié)果

3　討論

體外診斷試劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于體外診斷試劑的質(zhì)量控制尤為重要，是進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要物質(zhì)［7］，本實(shí)驗(yàn)采用的淋病PCR試劑盒質(zhì)控參考品為中檢：制備的國(guó)家參考品，用于淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。本研究對(duì)9種市售及3種正在進(jìn)行申報(bào)注冊(cè)檢驗(yàn)的淋球菌相關(guān)的核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）進(jìn)行檢測(cè)，旨在了解我國(guó)淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）的質(zhì)量狀況。結(jié)果顯示，各試劑盒均能正確區(qū)分陽(yáng)性參考品以及陰性參考品，符合率均達(dá)到100%。用精密度參考品檢測(cè)不同試劑盒的批內(nèi)精密度，其目的基因檢測(cè)通道的Ct值為13.22～30.00，CV值為0.3%～4.6%，均在5.0%以下，說明這12種試劑盒性能較穩(wěn)定，重復(fù)性好。但不同試劑盒的最低檢出限存在差異，12種試劑盒中的12種試劑盒中有10種試劑盒的最低檢出限能達(dá)到1×103個(gè)菌/mL，其中試劑盒D、J、K的最低檢出限能夠達(dá)到1× 102個(gè)菌/mL，靈敏度較高。但試劑盒I、L的最低檢出限僅達(dá)到1×104個(gè)菌/mL。對(duì)于注冊(cè)檢驗(yàn)的試劑盒，通過對(duì)同一企業(yè)不同批次樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各批次樣品的最低檢出限均符合相應(yīng)的產(chǎn)品技術(shù)要求，但各批次樣品的精密度存在一定差異。

淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）的原理是根據(jù)淋球菌特異性基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，在提取樣本DNA之后采用熒光PCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。11家企業(yè)的12種試劑盒均采用PCR與Taqman熒光探針相結(jié)合的技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，通過監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程熒光信號(hào)的變化，對(duì)未知模板進(jìn)行定性分析。常作為淋球菌檢測(cè)的靶基因有隱蔽性質(zhì)粒基因（cppB）［8］、染色體基因、透明蛋白（opa）基因［9］、PorA假基因［10-11］、菌毛DNA、rRNA基因［12］等，目前國(guó)內(nèi)淋球菌核酸試劑盒所采用的目的基因主要有cppB基因、opa基因、PorA假基因。cppB基因是較早應(yīng)用的靶基因［13］，但由于cppB基因在一些淋球菌菌株中缺乏［14-16］，存在出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，Bruisten等［17］認(rèn)為cppB基因不宜作為淋球菌基因擴(kuò)增的靶標(biāo)。近年來，較多使用的靶基因?yàn)閛pa基因和PorA假基因。本實(shí)驗(yàn)所使用的試劑盒分別含有這3種靶基因。試劑盒G、I、J、K、L均設(shè)有內(nèi)標(biāo)對(duì)照，參與樣本提取，并對(duì)整個(gè)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，可以有效排除假陰性結(jié)果，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)11家企業(yè)的12種淋球菌相關(guān)的核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明該類試劑盒的質(zhì)量較好，性能可靠，為此類產(chǎn)品的生產(chǎn)、研究及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)有效的依據(jù)。

［1］胡躍華，李鎰沖，劉世煒，等.中國(guó)20年間淋球菌、性傳播衣原體、梅毒螺旋體的發(fā)病情況及其疾病負(fù)擔(dān)［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2015，30（11）：904-910.

［2］高建華，黃若剛.北京市法定的5類性傳播疾病5年流行趨勢(shì)分析［J］.中國(guó)艾滋病性病，2014，20（1）：62-63.

［3］AbbaiNS，Moodley P，Reddy T，etal.Clinical evaluation of the One Step Gonorrhea Rapi Card Insta Test for detection of Neisseria gonorrhoeae in symptomatic patients from Kwa Zulu-Natal，South Africa［J］.JClin Microbiol，2015，53（4）：1348-1350.

［4］孫國(guó)清，薛秀娟，劉春華，等.酶法淋球菌試劑盒臨床性能研究［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（11）：47-48.

［5］胡耀華.淋病奈瑟菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9（11）：2194-2196.

［6］鐘春燕，章小花，裘新民，等.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在淋球菌檢測(cè)中的應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（23）：4041-4045.

［7］楊振，黃杰，于婷，等.我國(guó)體外診斷試劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)現(xiàn)狀及對(duì)策分析［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2015，28（7）：765-771.

［8］Ho BS，F(xiàn)eng WG，Wong BK，et al.Polymerase chain reaction for the detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples［J］.JClin Pathol，1992，45（5）：439-442.

［9］Tabrizi SN，Chen S，Tapsall J，et al.Evaluation of opabased realtimePCR fordetectionofNeisseriagonorrhoeae［J］. Sex Transm Dis，2005，32（3）：199-202.

［10］Hjelmevoll SO，Olsen ME，Sollid JU，et al.A fast realtimepolymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudo gene［J］.JMol Diagn，2006，8（5）：574-581.

［11］Whiley DM，Buda PJ，F(xiàn)reeman K，et al.Areal-time PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae in genital and extragenital specimens［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2005，52（1）：1-5.

［12］Mahony JB，Jang D，Chong S，et al.Detection of Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Ureaplasm aurealyticum and Mycoplasma genitalium in first-void urine specimens by multiplex polymerase chain reaction［J］. Mol Diagn，1997，2（3）：161-168.

［13］Farrell DJ.Evaluation of AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCRusing cppBnested PCR and 16SrRNAPCR［J］. JClinMicrobiol，1999，37（2）：386-390.

［14］Tapsall JW，LimniosEA，Nguyen NL，etal.Cryptic-plasmidfree gonococcimay contribute to failure of cppB genebased assays to confirm results of BD ProbeTEC PCR for identification of Neisseria gonorrhoeae［J］.JClinMicrobiol，2005，43（4）：2036-2037.

［15］Boel CH，van Herk CM，Berretty PJ，et al.Evaluation of conventional and real-time PCR assays using two targets for confirmationof results of the COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae test for detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples［J］.J Clin Microbiol，2005，43（5）：2231-2235.

［16］趙曉蘭，馮琳.四種方法檢測(cè)淋病奈瑟球菌的臨床應(yīng)用對(duì)比研究［J］.中國(guó)性科學(xué)，2015，24（7）：45-47.

［17］Bruisten SM，Noordhoek GT，van den Brule AJC，et al. Multicenter Validation of the cppB Gene as a PCR Target for Detection of Neisseria gonorrhoeae［J］.JClin Microbiol，2004，42（9）：4332-4334.

Evaluation ofquality conteol foePCR kitsin detection ofNeisseeiagonoeehea

WANGChun'e LU Xu SHIJichun LIU Rufeng LIHong CHEN Qiong TANG Jing CHEN Cuiping YEQiang

National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of Method and Standardization for Quality Control of Biotechnical Products，Ministry of Public Health，Beijing 100050，China

R515

A

1674-4721（2016）08（c）-0008-04

2016-05-10本文編輯：任念）

國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)國(guó)家微生物資源平臺(tái)獎(jiǎng)補(bǔ)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（NIMR 2016-2）。

王春娥（1980.10-），女，碩士，研究方向：醫(yī)學(xué)微生物菌種資源的保藏及研究，細(xì)菌類疫苗及體外診斷試劑質(zhì)量控制。

葉強(qiáng)（1964.12-），男，碩士，主任技師，中國(guó)食品藥品檢定研究：呼吸道細(xì)菌疫苗室主任；研究方向：醫(yī)學(xué)微生物菌種資源的保藏及研究，細(xì)菌類疫苗及體外診斷試劑質(zhì)量控制。