m iR-140-5p調(diào)控FGF9在拇外翻中的作用

羅純猛　金日龍　杜　健　李　力　馬　健　佟智慧.遼寧省撫順市中心醫(yī)：骨科外二科，遼寧撫順3006；.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)：骨科，遼寧沈陽(yáng)000

m iR-140-5p調(diào)控FGF9在拇外翻中的作用

羅純猛1金日龍1杜健2李力1馬健1佟智慧1
1.遼寧省撫順市中心醫(yī)：骨科外二科，遼寧撫順113006；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)：骨科，遼寧沈陽(yáng)110001

目的探討miR-140-5p調(diào)控FGF9在拇外翻中的作用，從基因?qū)用骊U明拇外翻的發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療拇外翻提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法收集2013～2015年于撫順市中心醫(yī)：就診的拇外翻患者（10例）和非拇外翻患者（5例）的第一跖骨內(nèi)側(cè)骨組織及表面軟組織樣本，運(yùn)用Western blot以及real-time PCR檢測(cè)各組織中miR-140-5p和FGF9的表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)差異進(jìn)行分析。利用人成骨細(xì)胞系hFOB1.19對(duì)骨保護(hù)素（OPG）和骨鈣素（OCN）進(jìn)行Western blot分析，驗(yàn)證miR-140-5p和FGF9的調(diào)控關(guān)系和對(duì)成骨細(xì)胞成骨能力的影響。結(jié)果拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)與非拇外翻患者比較，miR-140-5p表達(dá)顯著下降（P=0.0065），F(xiàn)GF9表達(dá)明顯增高（P= 0.0055）。上調(diào)miR-140-5p后FGF9mRNA表達(dá)顯著下降（P=0.0050），而下調(diào)miR-140-5p后FGF9mRNA表達(dá)顯著增加（P=0.0035）。與未轉(zhuǎn)染組比較上調(diào)miR-140-5p后OPG（P=0.0045）和OCN蛋白（P=0.0037）表達(dá)明顯增強(qiáng)，而下調(diào)miR-140-5p后OPG（P=0.0047）和OCN蛋白（P=0.0049）表達(dá)減弱。結(jié)論本研究初步證明了miR-140-5p與FGF9在拇外翻的病理過(guò)程中具有重要作用，這為拇外翻的病因以及診治研究提供了新的方向。[關(guān)鍵詞]拇外翻；m iR-140-5p；FGF9；成骨細(xì)胞

［Avsteact］Ovjective To discuss effects ofmiR-140-5p on FGF9 in hallux valgus，illuminate the pathogenesis of hallux valgus from the point of gene，which provides basic theoretical foundation for the treatment and prevention of hallux valgus.M ethods Samples of patientswith hallux valgus（10 cases）and without hallux valgus（5 cases）in the Fushun Central Hospital from 2013 to 2015 were collected，thus the expression of miR-140-5p and FGF9 in the first metatarsalmedial bone tissues and the surface of the soft tissueswere analyzed with Western blot and real-time PCR. Besides，Western blot analysis on OPG and OCN with osteoblast cell line hFOB1.19 were conducted；the effects and regulation relationship betweenmiR-140-5p and FGF9 on the osteogenic capacity of osteoblast cell line were verified. Results Compared with the first plantar toe joint of the patients without hallux valgus，themiR-140-5p of hallux valgus patients reduced remarkably（P=0.0065），F(xiàn)GF9mRNA increased obviously（P=0.0055）.After the increasing of miR-140-5p，F(xiàn)GF9mRNA was reduced remarkably（P=0.0050），and after the reducing ofmiR-140-5p，F(xiàn)GF9mRNA was increased remarkably（P=0.0035）.Compared with the untransfected group，OPG（P=0.0045）and OCN（P= 0.0037）protein increased aftermiR-140-5p was increased.While the decrease ofmiR-140-5p caused the weaken of OPG（P=0.0047）and OCN protein（P=0.0049）.Conclusion This experiment primarily proves the important functions thatmiR-140-5p and FGF9 having in the pathological process of hallux valgus，which provides new direction for the pathogenesis and diagnosis of hallux valgus.

［Key woeds］Hallux valgus；miR-140-5p；FGF9；Osteoblast

拇外翻是指拇趾偏離中線，向外傾斜大于正常生理性拇外翻角度，同時(shí)拇趾在縱軸上向外略有旋轉(zhuǎn)畸形。由于其復(fù)雜的解剖畸形給拇外翻的治療帶來(lái)很大的困難，而且拇外翻畸形嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)以及髖關(guān)節(jié)的畸形［1］。拇外翻最為主要的病理改變?yōu)榈谝货殴莾?nèi)翻合并跖骨頭內(nèi)側(cè)骨贅增生和拇囊炎［2-7］。但是該病理改變發(fā)病機(jī)制一直未被研究清楚，有研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）可以刺激的第一跖趾關(guān)節(jié)的軟組織增生，這為拇外翻的病理學(xué)研究提供了一個(gè)新的方向［8］。對(duì)FGFs的研究可能會(huì)闡明拇外翻骨贅形成的原因。

現(xiàn)有報(bào)道指出遺傳因素是拇外翻的最主要的內(nèi)部因素，研究發(fā)現(xiàn)拇外翻的患者很多都有家族史，遺傳獲得的體型及體質(zhì)可構(gòu)成特定的生物力學(xué)結(jié)構(gòu)及功能，在一定誘因的影響下可導(dǎo)致拇外翻的形成［9-10］，但是其具體機(jī)制并不明確，而且目前關(guān)于拇外翻的基因研究并不多見(jiàn)。已有學(xué)者在肝細(xì)胞中證實(shí)miR-140-5p對(duì)于FGF9 mRNA的調(diào)控作用［11］，因此推測(cè)在人成骨細(xì)胞中也存在此調(diào)控機(jī)制。本研究將從首次以拇外翻患者多余骨贅中miR-140-5p以及FGF9的差異表達(dá)入手，并應(yīng)用人體成骨細(xì)胞驗(yàn)證miR-140-5p對(duì)FGF9的調(diào)控作用和對(duì)成骨細(xì)胞成骨功能的影響，目的是明確拇外翻和miR-140-5p、FGF9之間的關(guān)系，進(jìn)一步探索拇外翻發(fā)病機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

選擇2013～2015年于撫順市中心醫(yī)：（以下簡(jiǎn)稱“我：”）就診的10例拇外翻患者，其中女9例，男1例，年齡20～75歲。選擇同期我：收治的因車(chē)禍至下肢血運(yùn)嚴(yán)重受損并導(dǎo)致截肢的5例非拇外翻患者，其中女3例，男2例，年齡20～60歲。術(shù)前獲得患者的同意并簽署知情同意書(shū)，拇外翻患者矯形手術(shù)中切除第一跖骨頭內(nèi)側(cè)骨贅帶表面軟組織，非拇外翻患者取第一跖骨頭內(nèi)側(cè)骨組織及表面軟組織。本研究經(jīng)遼寧省醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人成骨細(xì)胞株（hFOB1.19）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)：上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)基為DMEM∶F12=1∶1（Gibco），胎牛血清（上海洛神生物技術(shù)有限公司）。hFOB1.19需在34℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM∶F12=1∶1，添加終濃度為10%的胎牛血清及終濃度為0.3‰的G418（Amersco）。隔1 d換液1次。

1.3采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法上下調(diào)控m iR-140-5p的表達(dá)

由綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記，編碼has-miR-140-5p反義寡核苷酸鏈的慢病毒（lentivirus，LV）由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司包裝，分別用于體外培養(yǎng)hFOB 1.19細(xì)胞表達(dá)miR-140-5p的上調(diào)（LV-pre-miR-140-5p）或下調(diào)（anti-LV-miR-140-5p）。GFP標(biāo)記的空白慢病毒載體（LV-null）用作空白對(duì)照。以感染復(fù)數(shù)（MOI）=10進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)不同轉(zhuǎn)染情況分為：未進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染的正常hFOB 1.19細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組；轉(zhuǎn)染了LV-premiR-140-5p的hFOB 1.19細(xì)胞作為上調(diào)組；轉(zhuǎn)染了anti-LV-miR-140-5p的hFOB 1.19細(xì)胞作為下調(diào)組；轉(zhuǎn)染了LV-null的hFOB 1.19細(xì)胞作為上調(diào)對(duì)照組；轉(zhuǎn)染了anti-LV-null的hFOB 1.19細(xì)胞作為下調(diào)對(duì)照組。

1.4采用免疫組化檢測(cè)FGF9的表達(dá)

切片：經(jīng)取材后取得的組織置于多聚甲醛內(nèi)固定4 h后，后置于30%蔗糖溶液浸泡1周左右，使組織沉至溶液底部。制作蠟塊：應(yīng)用蠟塊切片機(jī)做正中矢狀面切片，厚度為10μm。切片后室溫放置1 h。應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法對(duì)組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。FGF9抗體購(gòu)于Abcam公司（貨號(hào)：ab71395），采用微波法修復(fù)抗原，并且應(yīng)用DAB法進(jìn)行顯色，最終通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，并且應(yīng)用Qwin（v2.3，Leica Inc.，德國(guó)）軟件對(duì)拍攝結(jié)果進(jìn)行定量分析用以判斷整體組織中FGF9的表達(dá)情況。

1.5采用real-time PCR檢測(cè)m iR-140-5p和FGF9 mRNA的表達(dá)

real-time PCR所用引物序列見(jiàn)表1。首先應(yīng)用Trizol法提取樣本中的總RNA并且測(cè)定OD260/OD280值以及RNA濃度，應(yīng)用Invitrogen（貨號(hào)：C28025-032）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，下一步使用TAKARA的SYBR Premis Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行real time PCR反應(yīng)，樣本通過(guò)94℃預(yù)變性2 min、94℃變性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s、74℃讀板、共40個(gè)循環(huán)后得到一個(gè)平均Ct值，通過(guò)該數(shù)值來(lái)計(jì)算mRNA的相對(duì)含量。最終結(jié)果運(yùn)用Comparative Delta-delta Ct法即ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，用來(lái)判斷miR-140-5p和FGF9mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1　Rea l tim e-PCR引物序列

1.6采用Western blot檢測(cè)骨保護(hù)素（OPG）和骨鈣素（OCN）的表達(dá)

從組織中提取總蛋白，并且應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白定量，之后通過(guò)制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫雜交反應(yīng)，ECL發(fā)光，拍照等步驟取得圖像，并通過(guò)bio-rad的Quantity One軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，用以判斷細(xì)胞中OPG和OCN蛋白的表達(dá)情況。OPG、OCN抗體購(gòu)于Abcam公司（貨號(hào)：ab183910、ab93876）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1拇外翻中FGF9與m iR-140-5p的關(guān)系

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非拇外翻患者及拇外翻患者骨組織中均有FGF9表達(dá)，拇外翻患者骨組織中FGF9的表達(dá)量明顯高于非拇外翻患者（P=0.0055）（圖1A）。拇外翻患者組織中miR-140-5p的表達(dá)量明顯低于非拇外翻患者（P=0.0065）（圖1B）。

圖1　拇外翻及非拇外翻患者骨組織中FGF9與m iR-140-5p的表達(dá)情況（SP染色，400×）

2.2成骨細(xì)胞中m iR-140-5p對(duì)FGF9的調(diào)控作用

在上調(diào)了miR-140-5p的表達(dá)之后，采用real time-PCR觀察miR-140-5p和FGF9mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組比較上調(diào)組中miR-140-5p mRNA的表達(dá)顯著升高（P=0.0052）（圖2A），而FGF9 mRNA的表達(dá)明顯下降（P=0.0050）（見(jiàn)圖2B）。在下調(diào)了miR-140-5p mRNA的表達(dá)之后，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組比較下調(diào)組中miR-140-5p的表達(dá)顯著降低（P= 0.0056）（見(jiàn)圖2A），而FGF9 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P=0.0045）（圖2B）。

圖2　成骨細(xì)胞中m iR-140-5p和FGF9 m RNA的表達(dá)情況

2.3m iR-140-5p和FGF9對(duì)成骨細(xì)胞成骨功能的影響

Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組比較，下調(diào)miR-140-5p的表達(dá)之后，OCN（P=0.0049）和OPG（P=0.0047）蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而上調(diào)miR-140-5p的表達(dá)之后，OCN（P=0.0037）和OPG（P= 0.0045）蛋白表達(dá)水平均顯著提高。見(jiàn)圖3。

圖3　成骨細(xì)胞中OPG和OCN的表達(dá)情況

3　討論

miR-140-5p已經(jīng)被證實(shí)在多種疾病中均具有重要作用，對(duì)于其功能研究主要集中在腫瘤方面，其作為下游靶蛋白抑制因素，在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中具有重要作用［12-13］。不僅如此，miR-140-5p在免疫系統(tǒng)中的作用也已得到驗(yàn)證［14］。在骨科的相關(guān)疾病中miR-140-5p也發(fā)揮著重要作用，在骨折愈合方面，通過(guò)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在骨折的大鼠體內(nèi)miR-140-5p的表達(dá)顯著增高［15］。有報(bào)道指出miR-140-5p在骨關(guān)節(jié)炎大鼠的病理發(fā)展過(guò)程中具有重要作用［16］。但是目前miR-140-5p與拇外翻之間相關(guān)性并沒(méi)有被明確。本研究發(fā)現(xiàn)miR-140-5p在非拇外翻患者與拇外翻患者之間的差異表達(dá)。雖然之前已有學(xué)者在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-140-5p可以調(diào)控FGF9mRNA的表達(dá)［11］，但是在成骨細(xì)胞中驗(yàn)證他們兩者之間的調(diào)控關(guān)系并不多見(jiàn)。本研究初步對(duì)拇外翻的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，這為拇外翻的治療以及預(yù)防提出了新的方向。

多余骨贅形成是拇外翻和拇囊炎的主要病因，但是其具體機(jī)制并不明確?，F(xiàn)有報(bào)道指出FGFs可以刺激拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)軟組織中的間充質(zhì)細(xì)胞增殖并且可能與拇外翻的發(fā)病具有密切關(guān)系［8］。到目前為止，F(xiàn)GFs家族中有23個(gè)家族成員被發(fā)現(xiàn)。FGFs來(lái)源于有脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物。它包含兩個(gè)大的內(nèi)含子序列，兩個(gè)內(nèi)含子功能區(qū)域可以分為3個(gè)外顯子區(qū)域，這是FGF家庭因素的特點(diǎn)之一。然而FGF 11～14的易位區(qū)域包含5個(gè)外顯子。FGF基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域?yàn)?～100 kb［17］。FGFs在膜內(nèi)成骨以及軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程中具有重要作用。FGFs可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并且抑制破骨細(xì)胞分化。FGF9普遍分布在整個(gè)脊椎動(dòng)物身體并具有很多生理功能?，F(xiàn)已證實(shí)FGF9在多發(fā)性骨性連接綜合征（SYNS）中具有重要作用［18］并且還可以促進(jìn)軟骨成骨［19］。FGF9還可以通過(guò)與FGFR-3結(jié)合促進(jìn)膜內(nèi)成骨［20］。因此本研究推測(cè)拇外翻骨贅形成可能與FGF9促進(jìn)骨形成作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在拇外翻患者的骨贅組織中FGF9的表達(dá)高于非拇外翻患者。并且成骨細(xì)胞的功能隨著FGF9的表達(dá)增高而增強(qiáng)。

成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。拇外翻患者第一跖趾關(guān)節(jié)處多余骨贅的形成標(biāo)志著成骨細(xì)胞成骨能力的亢進(jìn)。所以對(duì)于成骨細(xì)胞成骨能力的觀察是研究拇外翻病因的關(guān)鍵。OCN是骨礦化過(guò)程中必不可少的，其可以促進(jìn)骨形成，本研究應(yīng)用OCN檢測(cè)hFOB1.19細(xì)胞骨形成指標(biāo)。NF-κB配體的受體（RANKL）是破骨細(xì)胞生成、激活及存活必不可少的因素，而OPG是RANKL的可溶性誘餌受體，可以抑制RANKL對(duì)破骨細(xì)胞的作用［21］，因此本研究應(yīng)用OPG檢測(cè)hFOB1.19細(xì)胞骨吸收指標(biāo)。通過(guò)上述指標(biāo)充分反映成骨細(xì)胞的成骨能力。本研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的成骨能力與FGF9和miR-140-5p之間存在相關(guān)性。這也預(yù)示著FGF9和miR-140-5p可能是拇外翻畸形過(guò)程中的關(guān)鍵因素。

本實(shí)驗(yàn)明確了在拇外翻患者中miR-140-5p表達(dá)降低，導(dǎo)致FGF9表達(dá)增強(qiáng)并刺激第一跖趾關(guān)節(jié)局部骨組織異常增生，導(dǎo)致多余骨贅形成。目前對(duì)于拇外翻發(fā)病機(jī)制的研究并不多見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)初步證明了miR-140-5p與FGF9在拇外翻的病理過(guò)程中具有重要作用，但是明確拇外翻的具體發(fā)病機(jī)制還需要更深入的研究，希望本實(shí)驗(yàn)可以為拇外翻的病因以及診治研究提供一個(gè)新的方向。

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Effect of FGF9 eegulated vy m iR-140-5p on hallux valgus

LUO Chunmeng1JIN Rilong1DU Jian2LILi1MA Jian1TONG Zhihui1

1.The Second Surgical Department of Orthopedics，the Fushun Central Hospital，Liaoning Province，F(xiàn)ushun 113006，China；2.Department of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Liaoning Province，Shenyang 110001，China

R687.3

A

1674-4721（2016）08（c）-0004-05

2016-06-10本文編輯：任念）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81471094）。

佟智慧（1966.2-），男，碩士，主任醫(yī)師；研究方向：脊柱外科。