不同提取方法對(duì)植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影響

曾令達(dá)，黃 穎，曾海泉，尹 艷，宋冠華（.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 56007；2.惠州學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 56007；.惠州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 惠州 5602）

不同提取方法對(duì)植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影響

曾令達(dá)1，2，黃 穎1，曾海泉3，尹 艷1，2，宋冠華1，2
（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.惠州學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 516007；3.惠州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 惠州 516023）

采用浸泡提取法和超聲波提取法制備8種植物的粗提物，以菌絲生長(zhǎng)法和孢子囊萌發(fā)法測(cè)定抑荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）的活性，并對(duì)黃柏（Cortex phellodendri）粗提物的抑菌活性進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示，植物粗提物對(duì)荔枝霜疫霉菌絲生長(zhǎng)和孢子囊萌發(fā)抑制作用中，超聲波提取法優(yōu)于浸泡提取法，兩種方法制備的黃柏粗提物抑菌作用均較強(qiáng)，質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，黃柏超聲波提取法和浸泡提取法獲得的粗提物對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率都為100%、孢子囊萌發(fā)抑制率為61.77%和41.76%，黃柏超聲波提取法和浸泡提取法粗提物抑菌絲生長(zhǎng)的有效中濃度（EC50）分別為585.62、685.65 μg/mL。表明不同提取方法獲得的粗提物抑菌活性不同，超聲波提取法有利于抑荔枝霜疫霉活性物質(zhì)的提取，黃柏粗提物抑荔枝霜疫霉菌活性較高。

植物粗提物；荔枝霜疫霉；超聲波提取法；黃柏

曾令達(dá)，黃穎，曾海泉，等. 不同提取方法對(duì)植物粗提物抑制荔枝霜疫霉效果的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（8）：103-107.

荔枝霜疫霉（Peronophythora litchi）是荔枝霜疫霉病的病原菌［1］，荔枝霜疫霉病是目前最為嚴(yán)重的荔枝病害之一［2］。荔枝霜疫霉不僅為害近成熟的果實(shí)，也能為害花序、結(jié)果小枝、幼果和果柄等［3］。荔枝霜疫霉抑制和殺滅的研究，對(duì)防治荔枝霜疫霉病害和促進(jìn)荔枝生產(chǎn)具有重要意義。荔農(nóng)防治霜疫霉病的藥品大多數(shù)采用具有針對(duì)性的農(nóng)藥，如瑞毒霉系列，特別是瑞毒霉（雷多米爾）一般為首選用藥，但長(zhǎng)時(shí)間過于集中或局限于使用某一類藥，使病蟲的抗藥性不斷增大［2］。為了提高人類的生存環(huán)境質(zhì)量和食品質(zhì)量，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，人們開始轉(zhuǎn)向植物源農(nóng)藥的研究。植物源農(nóng)藥是國內(nèi)外新農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一［4］。自然界擁有豐富的荔枝霜疫霉生防資源，我國對(duì)70多個(gè)科近300多種植物開展了對(duì)荔枝霜疫霉生物敏感性測(cè)試，大部分試驗(yàn)利用溶劑法提取有效成分和離體活性測(cè)試［5］。植物抑菌殺菌成分復(fù)雜，作為生物活性化合物的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種［6］。浸泡提取法和超生波提取法是目前提取植物源抑菌殺菌物質(zhì)的主要方法［7］。浸泡提取法適合大多數(shù)活性物質(zhì)的提取，且比較簡(jiǎn)單易行。超生波提取法具有省時(shí)、節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、高效的提取新方法，并且提取中無加熱過程，因此可避免加熱因素引起的藥物成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可用于熱敏性成分的提?。?］。為了解浸泡提取法和超聲波提取法提取的植物粗提物對(duì)荔枝霜疫霉的抑制作用差異，本試驗(yàn)選用8種植物進(jìn)行植物活性物質(zhì)提取，比較不同植物和不同提取方法與抑菌活性的關(guān)系，并進(jìn)一步將抑菌效果較好的植物做抑菌有效中濃度（EC50）測(cè)定，以期為植物抑菌作用的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為開發(fā)天然水果保鮮劑和新型植物源殺菌劑提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試植物材料共6科8種植物（表1）?；ㄈ~良姜采自惠州學(xué)院校園，姜、百部、黃柏購于惠州市惠城區(qū)百姓緣藥店，火炭母、山蒼、苦參購于惠城區(qū)南門市場(chǎng)。荔枝霜疫霉由惠州學(xué)院生命科學(xué)系植物生理實(shí)驗(yàn)室提供。

表1　供試植物名錄

1.2制備植物粗提物

將所采集的鮮活植物陰涼處風(fēng)干后，與其他材料共置于60℃干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過0.425 mm篩，備用。

1.2.1浸泡提法制備植物粗提物 分別稱取60 g植物干粉于廣口瓶?jī)?nèi)，倒入適量（以浸沒材料為準(zhǔn)）的95%乙醇，在室溫下浸泡2次，期間搖動(dòng)數(shù)次，每次浸泡24 h。每次浸泡后，用真空抽濾泵抽濾得過濾液，混合兩次過濾液，乙醇定容至120 mL（提取液濃度是0.5 g/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2超聲波提取法制備植物粗提物 分別稱取60 g植物干粉于廣口瓶?jī)?nèi)，倒入適量 （以浸沒材料為準(zhǔn)）的95%乙醇，在室溫下浸泡5 h，期間搖動(dòng)數(shù)次，將混合物于40℃下200 W、40 kHz超聲波（中國三源）提取1 h，過濾，乙醇定容至120 mL（提取液濃度是0.5 g/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抑菌活性測(cè)定

1.3.1抑菌絲生長(zhǎng)測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)速率法參照曾令達(dá)等［9］的方法，將粗提物配成一定濃度的帶藥培養(yǎng)基，把菌餅接入培養(yǎng)基4 h后倒置培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。抑菌率（%）=100（對(duì)照凈生長(zhǎng)量-處理凈生長(zhǎng)量）/對(duì)照凈生長(zhǎng)量，其中凈生長(zhǎng)量=菌落直徑-菌餅直徑。將抑菌百分率換算成幾率值，質(zhì)量濃度以對(duì)數(shù)值表示，以各粗提物不同質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（X）減去菌落生長(zhǎng)抑制率的幾率值（Y），求取毒力回歸方程 Y =a+bX，并計(jì)算抑制菌絲生長(zhǎng)的EC50值。

1.3.2抑孢子囊萌發(fā)測(cè)定 孢子囊萌發(fā)法參照曾令達(dá)等［9］的方法，吸取50 μL藥液與5 mL懸浮液于28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h開始鏡檢，以孢子芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑50%視為已萌發(fā)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

2　結(jié)果與分析

2.1不同粗取物對(duì)荔枝霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表2可以看出，8種植物粗提物對(duì)霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，除黃柏在兩種提取方法中獲得的粗提物其抑菌率均為100%外，超聲波提取法在姜、花葉良姜、陰香和百部等4種植物的抑菌率高于浸泡法，占57.14%?？鄥?、火炭母和山蒼子等3種植物浸泡法提取法的抑菌率高于超聲波提取法，占42.86%。從抑菌率看，超聲波提取法優(yōu)于浸泡提取法?？鄥⒊暡ǚù痔嵛锖涂鄥⒔莘ù痔嵛飳?duì)荔枝霜疫霉病菌菌絲抑制率分別為76.88%、80.64%，兩種提取方法獲得的粗提物抑菌活性較高。陰香、百部浸泡提取的粗提物抑菌率為負(fù)值，分別為-9.41%和-9.77%。山蒼子浸泡法和超聲波法提取的粗提物抑菌率均為負(fù)值，分別為-17.94%和-19.04%。抑菌率為負(fù)值說明陰香、百部和山蒼子粗提物具有促進(jìn)霜疫霉病菌菌絲生長(zhǎng)的物質(zhì)。

表2　不同粗提物對(duì)霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2不同粗取物對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)的抑制作用

從表3可以看出，8種植物粗提物對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)的抑制作用中，黃柏、苦參、姜、陰香、百部和山蒼子等6種植物超聲波法粗提物抑菌率高于浸泡法，占總材料中的75%，僅花葉良姜和火炭母2種植物浸泡法粗提物抑菌率比超聲波法高。黃柏和苦參的超聲波粗提物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)抑制率大于50%，分別為61.77%、51.39%。黃柏、苦參、姜、花葉良姜、火炭母和山蒼子植物的浸泡粗提物，以及姜和陰香超聲波粗提物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)抑制率低于50%。陰香和百部的浸泡法粗提物，花葉良姜、火炭母和百部植物的超聲波法粗提物對(duì)荔枝孢子囊萌發(fā)為負(fù)值，起促進(jìn)作用。8種植物萌發(fā)抑制率大小不一，萌發(fā)抑制率的大小跟植物的抑菌活性和粗提物的測(cè)試濃度有關(guān)，陰香等5種植物萌發(fā)率起促進(jìn)作用可能跟粗提物中含有促進(jìn)孢子萌發(fā)的物質(zhì)有關(guān)。

2.3不同濃度黃柏粗提物對(duì)霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

對(duì)不同提取方法獲得的粗提物進(jìn)行濃度梯度測(cè)試，隨著濃度的提高，兩種方法獲得的粗提物抑菌活性增強(qiáng)。黃柏超聲波粗提物的毒力回歸方程為Y = -1.8043+2.4586X，EC50= 585.62 μg/mL；黃柏浸泡粗提物的毒力回歸方程為Y = -0.9748+2.1067X，EC50= 685.65 μg/mL（表4）。

3　結(jié)論與討論

植物活性物質(zhì)的提取方法很多［10］，提取方法不同，獲得的植物源抑菌殺菌物質(zhì)的種類和含量不同，其藥效也就不同［11-12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同提取方法獲得的粗提物對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌活性不同，粗提物對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子囊萌發(fā)抑制作用中，超聲波提取法優(yōu)于浸泡提取法。超聲波提取法獲得的粗提物，除黃柏菌絲生長(zhǎng)抑菌率都達(dá)到100%外，其余7種植物中有4種植物對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑菌效果較好，占57.14%；對(duì)孢子囊萌發(fā)抑制中，有5種植物抑制效果較好，占75.00%。程敏等［13］以食品常見致病菌為供試菌，探討南五味子3種不同提取方法所得乙醇提取物對(duì)致病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)超聲波提取法所得乙醇提取物對(duì)3 種致病菌的抑制作用最強(qiáng)。不同提取方法對(duì)黃連中小檗堿含量的影響和相應(yīng)提取物的抑菌性能研究中，以超聲波提取效果最佳［14］。植物抑菌物質(zhì)復(fù)雜，有些侵提法的抑菌率比超聲波法高，但相對(duì)于侵提法，超聲波法能通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度以增大質(zhì)的穿透力以提取中藥的有效成分的方法［12］，可能是在8種植物材料中超聲波法較優(yōu)的原因。本試驗(yàn)中，黃柏菌絲生長(zhǎng)抑菌率兩種方法都達(dá)100%，說明黃拍粗提物中含有較高的抑菌活性物質(zhì)，而在孢子囊萌發(fā)抑制中，超聲波提取的粗提物中孢子囊萌發(fā)抑制率是61.77%；黃柏浸提物為41.76%，正好說明超聲波提取法有利于黃拍的抑菌物質(zhì)的提取。因此，在相同溶劑提取中，超聲波提取法有利于抑菌物質(zhì)的提取，在植物源抑菌劑研究中，可作為植物粗提物抑菌活性大小篩選中的一種提取方法。

表3　不同粗提物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)的抑制作用

表4　不同濃度黃柏粗提物對(duì)霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

本試驗(yàn)的8種植物粗提物中，在5 mg/mL條件下，黃柏粗提物抑制荔枝霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的效果最佳，達(dá)到100%，具有較強(qiáng)的抑菌作用。呂君一等［15］研究發(fā)現(xiàn)黃柏以乙醇為溶劑的超聲波提取物對(duì)西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用，該結(jié)果與本試驗(yàn)類似。曾勇等［16］用苦參的甲醇提取物中藥10 mg/mL濃度處理荔枝霜疫霉病菌其菌絲生長(zhǎng)抑制率為89.10%，認(rèn)為苦參抑菌活性較強(qiáng)。本試驗(yàn)中浸泡法和超聲波法兩種方法提取的苦參粗提物中5 mg/mL條件下抑菌率分為80.64%和76.88%，兩者試驗(yàn)結(jié)果較為一致。本試驗(yàn)植物中花葉良姜、姜和火炭母粗提物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌效果并不理想，而陰香、百部和山蒼子對(duì)菌絲生長(zhǎng)能起促進(jìn)作用，說明不同的植物其抑菌效果不同，甚至有些反而具有促進(jìn)病菌生長(zhǎng)的效果。這可能與其抑菌活性物質(zhì)對(duì)菌種的效應(yīng)不同，或是粗提物中存在促進(jìn)供試菌菌絲生長(zhǎng)的物質(zhì)有關(guān)。

黃柏具有抗菌作用，常用于抑菌研究。都日娜等［17］研究發(fā)現(xiàn)黃柏具有抗炎、抗菌等作用，有良好的開發(fā)前景，在果蔬保鮮上也是使用較多的抑菌植物［18］。為進(jìn)一步了解黃拍的抑菌活性，本試驗(yàn)測(cè)定了黃柏的抑荔枝霜疫霉菌絲生長(zhǎng)的EC50，發(fā)現(xiàn)黃柏超聲波粗提物和浸泡粗提物的抑菌EC50分別585.62、685.65μg/mL。在植物提取物對(duì)荔枝霜疫霉的抑制研究中，吳光旭［19］發(fā)現(xiàn)開口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯分部萃取物和正丁醇分部萃取物抑制荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為1 598.10、662.86、1 147.31 μg/mL，用甲醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶液處理，荔枝果實(shí)接種感病率明顯降低，并且上述提（萃）取物具有防治荔枝貯藏病害發(fā)生和延緩主要品質(zhì)性狀劣變的作用。甘草甲醇提取物的抑荔枝霜疫霉的EC50為0.62 mg/mL［20］。黃柏超聲波粗提物的EC50較開口箭乙酸乙酯分部萃取物和甘草甲醇提取物的EC50小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃柏粗提物對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌活性強(qiáng)，可以作為進(jìn)一步研究材料。

［1］ 陶挺燕，何凡，范鴻雁，等. 荔枝霜疫霉病病原菌生物學(xué)特性研究［J］. 中國南方果樹，2010，39（3）：44-46.

［2］ 姜子德，習(xí)平根，冼繼東，等. 對(duì)未來五年我國荔枝植保研究的思考［J］. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2011，42（5）：61-63.

［3］ 戚佩坤，潘雪萍，劉任. 荔枝霜疫霉病的研究. I.病原菌的鑒定及其侵染過程［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，1984，14（2）：113-119.

［4］ 張興，馬志卿，馮俊濤，等. 植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展［J］. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（5）：685-698.

［5］ 徐遲默，謝龍蓮，曾筱芬，等. 荔枝霜霉病生物防治研究進(jìn)展［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46（1）：72-78.

［6］ Swain T. Secondary compounds as protective agents［J］. Ann Rev of Plant Physiol，1997，28：479-501.

［7］ 張濤，王貴清. 植物源抑菌殺菌物質(zhì)提取方法研究進(jìn)展［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（13）：59-62.

［8］ 鐘玲，尹蓉莉，張仲林. 超聲提取技術(shù)在中藥提取中的研究進(jìn)展［J］. 西南軍醫(yī)，2007，9（6）：84-86.

［9］ 曾令達(dá)，張榮，蔡韞，等. 17種植物提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制作用［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（12）：89-92.

［10］ 郭維圖. 中藥提取新老工藝技術(shù)淺談［J］. 醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)雜志，2005，26（1）：41-46.

［11］ 史萬忠，劉力，沈培芝，等. 不同提取方法對(duì)養(yǎng)血軟堅(jiān)方的指標(biāo)成分及主要藥效的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2003，14（2）：125-127.

［12］ 王勝春，宋嶺，王汝娟. 不同提取方法對(duì)清溫沖劑部分藥效學(xué)的影響［J］. 中成藥，1994，16 （10）：6-7.

［13］ 程敏. 南五味子不同提取方法的乙醇提取物抑菌活性研究［J］. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61 （3）：15-17.

［14］ 李斌輝，王潔，王雅梅. 不同提取方法對(duì)黃連中小檗堿含量及抑菌性能的影響［J］. 中國藥房，2015，26（5）：46-49.

［15］ 呂君一，潘健，于佳霖，等. 黃柏抑菌成分超聲波提取工藝研究［J］. 上海蔬菜，2015（3）：62-64.

［16］ 曾勇，羅建軍，丘麒，等. 23種植物提取物對(duì)荔枝霜疫霉病菌的抑菌活性［J］. 華中農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：780-784.

［17］ 都日娜，烏日娜. 黃柏的研究進(jìn)展［J］. 中國民族醫(yī)藥雜志，2008（3）：75-76.

［18］ 周建新. 植物源天然食品防腐劑的研究現(xiàn)狀、存在問題及前景［J］. 食品科學(xué)，2006，27 （1）：163-165.

［19］ 吳光旭，劉愛媛，陳維信. 開口箭提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制作用及其對(duì)荔枝果實(shí)的貯藏效果［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（8）：1703-1708.

［20］ 羅建軍，翁群芳，胡美英. 抑菌植物的篩選及甘草對(duì)5種植物病原真菌抑菌活性的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：356-360.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Effects of extraction method on amtifugal activity of plant extract to Peronophythora litchi

ZENG Ling-da1，2，HUANG Ying1，ZENG Hai-quan3，YIN Yan1，2，SONG Guang-hua1，2
（1.Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，China；2. Institute of Biotechnology， Huizhou University，Huizhou 516007，China；3.Huizhou Agricultural Science Research Institute，Huizhou 516023，China）

Eight kinds of plant extracts were obtained by ultrasonic extraction and organic solvent soaking method，and their inhibitory effects on mycelial growth and sporangial germination of Peronophythora litchi were tested. Results showed that the effect by ultrasonic extraction was better than that by soaking extraction. The extracts from Cortex phellodendri either by ultrasonic or by soaking extraction had the strongest anti-fungal activities among the 8 extracts. At the concentration of 5 mg/mL，the inhibition rate of extracts from C. phellodendri with ultrasonic extraction on mycelial growth was 100%，and on the sporangium germination was 61.77%；that of the extracts from C. phellodendri with saoking extraction on mycelial growth was also 100%，and on the sporangium germination was 41.76%. The EC50values of extracts from C. phellodendri with ultrasonic extraction and soaking extraction on inhibiting mycelial growth of P. litchi were 585.62 μg/mL and 685.65 μg/mL，respectively. Ultrasonic extraction method was suitable for extracting plant-sourced anti-fungal substances，the extracts from C. phellodendri had high inhibitor activities on P. litchi.

plant extract；Peronophythora litchi Chen；ultrasonic extraction；Cortex phellodendri

S482.2+92

A

1004-874X（2016）08-0103-05

2016-05-13

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020304010）；惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B010001024）；惠州學(xué)院自然科學(xué)項(xiàng)目（C2110220）

曾令達(dá)（1974-），男，碩士，副教授，E-mail：hzlingda@139.com