張愛玲,孫顯月,尹 琪,李加琪,張 豪(1. 廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心,廣東 廣州 5100;. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室,廣東 廣州 51064;. 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司,廣東 云浮 57400)
豬羰基還原酶1(CBR1)基因克隆及組織表達(dá)譜分析
張愛玲1,2,孫顯月2,尹 琪3,李加琪2,張 豪2
(1. 廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心,廣東 廣州 510303;2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室,廣東 廣州 510642;3. 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司,廣東 云浮 527400)
為了深入研究豬羰基還原酶1(CBR1)基因的表達(dá)調(diào)控,通過PCR獲得包括豬CBR1基因啟動子和外顯子、內(nèi)含子的序列,并進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較,通過RT-PCR方法檢測了CBR1基因在不同組織的表達(dá)豐度。結(jié)果表明,豬CBR1基因啟動子區(qū)長度為2 875 bp,具有潛在典型的NFκB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;CBR1基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,外顯子長度分別為289、108和437 bp,其中5′UTR和3′UTR分別為107 bp和242 bp,內(nèi)含子長度分別為572 bp和3 219 bp,編碼區(qū)由289個氨基酸組成;該蛋白為親水性蛋白,無明顯的信號肽,有2個跨膜區(qū)域;蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)主要由7 個α-螺旋、7個β-折疊以及l(fā)oop環(huán)構(gòu)成。豬CBR1基因氨基酸序列與人、綿羊氨基酸的相似性較高,為84.48%。qRT-PCR結(jié)果表明,懷孕12 d的二花臉子宮內(nèi)膜中CBR1基因mRNA的表達(dá)量極顯著高于長大二元母豬;在懷孕12 d母豬9個組織中,CBR1在腎臟中的表達(dá)量最高,其次是肝臟和小腸 。
豬;CBR1;基因表達(dá);啟動子
張愛玲,孫顯月,尹琪,等. 豬羰基還原酶1(CBR1)基因克隆及組織表達(dá)譜分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,43(8):151-157.
母豬妊娠的建立和維持是一個復(fù)雜的生理過程,子宮內(nèi)環(huán)境、子宮內(nèi)膜發(fā)生了巨大變化,同時多種生殖激素在該過程中發(fā)揮著重要作用。其中,前列腺素(Prostaglandins,PG)對妊娠識別和建立具有重要作用。前列腺素包括PGF2α、PGE2、PGH2等多個成員,但是各自功能大不相同,如PGF2α具有溶解黃體的功能[1],而PGE2具有黃體保護(hù)作用,PGE2能夠刺激懷孕10~12 d母豬黃體細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)[2],并通過抑制黃體溶解從而促進(jìn)妊娠建立和維持[3-4]。由于PGE2可以轉(zhuǎn)變?yōu)镻GF2α,而兩者具有相反的生理功能,因此PGE2與PGF2α比例(PGE2/PGF2α)必須受到嚴(yán)格調(diào)控才能適應(yīng)機(jī)體生理狀態(tài)并為妊娠做準(zhǔn)備。研究表明,較高的PGE2/PGF2α比例可能是我國高繁殖力豬種二花臉豬具有高產(chǎn)仔數(shù)性狀的一個因素[5]。羰基還原酶1(Carbonyl Reductase 1,CBR1)是催化PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)變過程中的一個限速酶,影響PGE2/PGF2α比例的高低。有文獻(xiàn)報道,在母豬懷孕早期胎兒尚未附植時,來自孕體分泌的不斷升高的雌激素會降低CBR1水平,進(jìn)而增強(qiáng)PGE2水平和PGE2/PGF2α比例[6]。研究表明,人工授精14 d后的懷孕母豬外周血中的CBR1表達(dá)水平要低于非懷孕母豬[7],同樣說明低水平的CBR1意味著較高的PGE2/PGF2α比例,進(jìn)而有利于妊娠的維持。此外,CBR1還在類固醇代謝、藥物代謝、解毒、藥物抗性、變異發(fā)生、認(rèn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生等生理過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。因此,CBR1基因的表達(dá)調(diào)控就顯得尤為重要,CBR1基因的表達(dá)強(qiáng)度實際上決定了其催化強(qiáng)度。已發(fā)現(xiàn)人類CBR1基因啟動子上存在多個特異的順式作用元件[10],且通過AHR通路激活CBR1基因的表達(dá)。目前,對豬CBR1基因啟動子的關(guān)注并不多。為了深入研究豬CBR1基因的表達(dá)調(diào)控,本研究將對其啟動子和編碼區(qū)等進(jìn)行克隆及蛋白性質(zhì)分析,并檢測其在不同豬種子宮內(nèi)膜等組織中的表達(dá),為探索豬繁殖性能分子機(jī)制調(diào)控積累資料。
1.1試驗材料
懷孕第3胎的3頭純種二花臉母豬(ER)和3頭長白、大白雜交母豬(LY)來自廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司,分別采集耳組織和子宮內(nèi)膜上皮組織,用于獲得基因片段克隆的DNA模板和cDNA模板。
1.2試驗方法
1.2.1DNA和RNA的提取 耳組織DNA提取參考基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)操作說明書進(jìn)行,子宮內(nèi)膜等組織總RNA提取按照Invitrogen Trizol 操作說明書,總RNA的反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。
1.2.2CBR1基因序列的克隆 參照GenBank上公布的豬CBR1基因(Gene ID:397143)部分序列,采用Primer軟件設(shè)計引物CBR1-5′擴(kuò)增啟動子序列,引物CBR1-In1和CBR1-In2擴(kuò)增內(nèi)含子序列,具體見表1,引物由廣州英駿公司合成,所用模板是DNA。普通PCR擴(kuò)增體系為50 μL,其中5×PrimerSTARTMBuffer(含Mg2+)10 μL,dNTP 4 μL,上下游引物各1μL,DNA模板1μL,PrimerSTARTMHS DN Polymerase 為0.5 μL,添加雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,退火溫度為58~62℃,72℃延伸3 min,然后轉(zhuǎn)至94℃,33個循環(huán)數(shù),最后72℃后延伸10 min。
1.2.3CBR1基因組織表達(dá)譜分析 采用實時熒光定量PCR,檢測CBR1基因在各組織的表達(dá)水平。采用SYBR Green Realtime PCR Mix,按照說明進(jìn)行。首先,設(shè)計CBR1基因的熒光定量PCR的引物q-CBR1及內(nèi)參引物q-RPS20(表1)。熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL:SYBR /RoX qPCR Master Mix(2×)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板0.6 μL,補(bǔ)充滅菌雙蒸水8.6 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán);72℃后延伸40 s。
表1 豬CBR1基因克隆和mRNA熒光定量PCR引物信息
1.2.4豬CBR1基因的生物信息學(xué)分析 豬CBR1基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點通過在線軟件分析:http://www.genomatix.de/,MatIspector
CpG島預(yù)測:http://www.uragene.org/ methprimer/indexl.html
核酸序列比對、拼接:D N A M A N、DNASTAR、Vector NTI等軟件
蛋白基本理化性質(zhì)預(yù)測:http://www.expasy. org/cgi-bin/protscale.pl,ExPASy 的ProtScal 程序
蛋白跨膜預(yù)測:http://www.ch.embnet.org/ software/TMPRED_form.html,TMpred
信號肽預(yù)測:http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/
蛋白結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測:http://www.expasy. org/prosite/蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測:http://www.expasy.org蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測:http://swissmodel. expasy.org/
蛋白質(zhì)分子進(jìn)化分析:http://www.ebi.ac.uk/ clustalw
1.3數(shù)據(jù)分析
樣品設(shè)置相同的閾值線,用CFX Manager軟件輸出擴(kuò)增的Ct值,在Excel表格中采用2-△△Ct法分析組織相對表達(dá)量,選擇RPS20基因作為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行均一化處理[11],以二花臉(ER)中CBR1作為參照因子,從而得到二花臉和長大二元雜豬種中CBR1基因的相對表達(dá)量,同時進(jìn)行t檢驗分析差異顯著性。CBR1基因的9個組織表達(dá)譜分析以β-actin基因作為內(nèi)標(biāo)基因,其他分析同上。
2.1豬CBR1基因及其啟動子的克隆
以長大二元雜母豬基因組DNA為模板,根據(jù)GenBank公布的豬CBR1基因(Gene ID:397143)部分序列設(shè)計引物CBR1-5′進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得2 997 bp序列(圖1),與網(wǎng)上mRNA序列比對,獲得了轉(zhuǎn)錄起始位點前面2 875 bp的5′調(diào)控區(qū),其中-2370~-1304共1 067 bp是參考序列的缺失序列。通過CBR1-In1 和CBR1-In2引物分別擴(kuò)增獲得883、3 611 bp片段(圖1),將其測序后與mRNA序列比對可知,獲得的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2長度分別為572、3 219 bp,且內(nèi)含子邊界符合GT-AG規(guī)則,5′UTR為107 bp,編碼區(qū)1、2、3長度分別為289、108、473 bp,3′UTR為242 bp,CBR1基因編碼區(qū)由867個堿基組成,編碼298個氨基酸。將所獲的上述序列拼接后,提交GenBank獲得登錄號為JQ743647。
圖1 豬CBR1基因啟動子和內(nèi)含子序列的擴(kuò)增
2.2豬CBR1基因啟動子的生物信息學(xué)分析
將豬CBR1基因啟動子區(qū)序列通過在線軟件進(jìn)行分析,預(yù)測啟動子區(qū)潛在的順式作用元件和反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子),結(jié)果如圖2所示。豬CBR1基因5'調(diào)控區(qū)存在典型的TATA box、GCbox等順式作用元件;存在與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,如cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 (CCAAT/ enhancer binding protein,C/EBP)、E-box結(jié)合因子(E-box binding factors)、TATA盒結(jié)合蛋白因子(Vertebrate TATA binding protein factor,VTBP)、核因子κB(nuclear factor κB,NFκB)、OCT-1等結(jié)合位點;通過Uragene預(yù)測發(fā)現(xiàn),豬CBR1基因啟動子不存在明顯的CpG島。
圖2 豬CBR1 基因啟動子區(qū)重要調(diào)控元件域結(jié)合因子預(yù)測
2.3豬CBR1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與同源性分析
2.3.1豬CBR1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 通過ProtParam在線軟件,預(yù)測豬CBR1蛋白質(zhì)總分子量為31 693.3 ku,理論pI值為7.60,正/負(fù)電荷殘基數(shù)為33/34,不穩(wěn)定系數(shù)為41.49(一般<40為穩(wěn)定、>40為不穩(wěn)定);脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為 88.69,總平均親水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為 -0.219,推測該蛋白為親水性蛋白。通過預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該蛋白無明顯的信號肽區(qū)域。通過InterProScan,發(fā)現(xiàn)豬CBR1基因存在兩個功能結(jié)構(gòu)域:7~148位氨基酸為短鏈脫氫酶(short-chain dehydrogenase)功能域,5~271位為NAD(P)結(jié)合域。
豬CBR1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由loop環(huán)構(gòu)成,α螺旋(H,helix)和β折疊(E,sheet)比例總和低于50%(圖3)。利用在線軟件TMpred對蛋白進(jìn)行跨膜分析,結(jié)果(圖4)顯示,按膜的取向來分,由內(nèi)向外無明顯的跨膜信號,而由外向內(nèi)則有兩個較明顯的跨膜螺旋區(qū),分別為7~23位氨基酸和189~209位氨基酸,但從分值來看并不顯著。利用SWISS-MODEL工具對該蛋白質(zhì)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,并與人CBR1蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)雖然兩者存在氨基酸數(shù)目的差異,但是兩者的三級結(jié)構(gòu)非常類似,由7個α-螺旋、7個β-折疊以及大部分的loop環(huán)構(gòu)成(圖5)。
圖3 豬CBR1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析
圖4 豬CBR1蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果
圖5 豬和人CBR1蛋白三級結(jié)構(gòu)比較
2.3.2豬CBR1蛋白質(zhì)同源性分析 通過Clustal Omega軟件,將人、豬、牛、綿羊、小鼠、雞、斑馬魚7個物種CBR1基因開放閱讀框轉(zhuǎn)錄所得氨基酸序列相似性分析,并進(jìn)行鄰接聚類和同源性分析,構(gòu)建蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)化分支圖(圖6)。豬CBR1基因編碼289個氨基酸,而其他多個物種編碼氨基酸數(shù)目在277個左右。對于CBR1氨基酸序列,豬與人和綿羊有更高的相似性,為84.48%;與牛和小鼠相似性分別為83.33%和79.78%;與雞和斑馬魚的相似性較低,分別為73.19%和60.51%。
圖6 7個物種CBR1蛋白氨基酸序列進(jìn)化分支
2.4豬CBR1基因在長大雜和二花臉豬子宮內(nèi)膜表達(dá)及不同組織表達(dá)譜分析
用RPS20作為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn),以二花臉豬(ER)中的CBR1基因作為參考基因進(jìn)行定量PCR分析,檢測了CBR1基因在二花臉和長大二元母豬懷孕12~13 d子宮內(nèi)膜的表達(dá)差異,表明二花臉子宮內(nèi)膜CBR1基因mRNA表達(dá)量顯著高于長大二元雜母豬(圖7A)。通過定量PCR分析了二花臉母豬懷孕第12天二花臉母豬的9個組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌、背膘、子宮內(nèi)膜)中的表達(dá)量(圖7B),CBR1基因在9種組織中呈不同程度表達(dá),其中在腎臟表達(dá)量最高,其次是肝臟和小腸、背膘,而在背最長肌和子宮內(nèi)膜呈低豐度表達(dá)。
圖7 豬CBR1基因組織表達(dá)譜分析
為了深入研究豬CBR1基因的表達(dá)調(diào)控,本研究首先克隆了豬CBR1基因的啟動子區(qū),并完善了GenBank公布的參考序列所缺失的堿基序列。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明,該基因啟動子潛在的轉(zhuǎn)錄因子包括NFκB、OCT-1、CREB等,值得注意的是存在兩個潛在的NFκB結(jié)合位點(-1539和-876位置)。研究表明,人和鼠的子宮內(nèi)膜中,NFκB作為炎性因子被激活并與胚胎附植有關(guān)[12-13]。在母豬發(fā)情周期的中期(即卵泡期),子宮內(nèi)膜會發(fā)生炎性反應(yīng),為受精卵的植入做準(zhǔn)備,NFκB已經(jīng)被證明作為轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)一些基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生,如在植入前期和懷孕母豬子宮內(nèi)膜中NFκB成員RELA表達(dá)量會增加[14]。在母豬發(fā)情周期、胚胎植入以及妊娠等炎性事件中,黃體變化起著重要作用,而由于PGE2和PGF2α對黃體分別具有保護(hù)和溶解功能,因此作為催化PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)化的限速酶,CBR1的表達(dá)調(diào)控更受到關(guān)注。但是,CBR1基因是否也像其他基因一樣受到NFκB的調(diào)控作用僅通過生物信息學(xué)預(yù)測是不夠的,雖然在-1539 和-876位置都存在NFκB典型的結(jié)合序列5′-GGGRNNYYCC-3′(R:嘌呤,Y:嘧啶,N:任意堿基),但仍需要進(jìn)一步驗證。相比人CBR1基因,豬CBR1基因啟動子上并不存在明顯的CpG島,推測豬CBR1基因啟動子可能受甲基化調(diào)控程度較低,且在人CBR1基因啟動子中并未發(fā)現(xiàn)TATA和CAAT框這兩個典型的順式作用元件[10]。有研究人員對7個狗品種CBR1基因進(jìn)行多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)在啟動子區(qū)存在Sp1結(jié)合區(qū)域,在5'UTR區(qū)存在10 bp的缺失突變[15],且該缺失區(qū)域可能會影響某抗癌藥物應(yīng)答。
利用生物信息學(xué)相關(guān)方法對豬CBR1蛋白進(jìn)行基本性質(zhì)分析,推測該蛋白為一種親水性蛋白,沒有明顯的信號肽區(qū)域。預(yù)測豬CBR1肽鏈由外向內(nèi)有兩個較明顯的跨膜螺旋區(qū),分別為7~23位氨基酸和189~209位氨基酸,結(jié)合二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果,這兩個區(qū)域主要由α-螺旋構(gòu)成,這也與其潛在的跨膜功能相適應(yīng)。豬CBR1基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成,與人、小鼠等物種CBR1基因結(jié)構(gòu)相同,但是在C-端編碼氨基酸數(shù)目則比人、小鼠等多12個,但比較豬和人CBR1基因三級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)均由7個α-螺旋、7個β-折疊以及l(fā)oop環(huán)構(gòu)成,多出的12個氨基酸并沒有導(dǎo)致豬CBR1蛋白與人CBR1蛋白三級結(jié)構(gòu)存在較大差異;而且在豬CBR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)了SDR和NAD (P)功能結(jié)構(gòu)域,這與劉珊[16]對人CBR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。從氨基酸聚類結(jié)果可以看出,哺乳動物CBR1基因的保守性較高,與雞和斑馬魚一致性較低。
通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn),懷孕11~12 d的二花臉母豬子宮內(nèi)膜CBR1基因的表達(dá)量高于長大二元母豬。二花臉豬是我國產(chǎn)仔數(shù)最高的品種,屬于太湖豬,研究表明產(chǎn)前低死亡率是太湖豬高產(chǎn)的主要原因,且較高的PGE2/PGF2α比例可能是有利于高產(chǎn)仔數(shù)的一個因素[5]。而本研究發(fā)現(xiàn),相比長大二元母豬,CBR1基因在二花臉子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平較高,意味著二花臉母豬子宮內(nèi)膜PGE2/PGF2α比例可能低于長大二元母豬,看似與已有研究結(jié)果相矛盾,但分析其中的原因可能是CBR1并不是作為PGE2向PGF2α轉(zhuǎn)化唯一的限速酶在發(fā)揮作用。另外CBR1基因在機(jī)體多個組織中呈現(xiàn)差異表達(dá),如在人16個組織中CBR1在肝臟中的表達(dá)量明顯高于其他各組織,而在二花臉母豬9個組織中,CBR1基因在腎臟中的表達(dá)量較高,在肝臟呈中度表達(dá),子宮內(nèi)膜表達(dá)量較低,物種間的差異是造成該基因在相同組織表達(dá)譜差異的因素之一。CBR1基因在豬不同組織中呈不同豐度表達(dá),表明其表達(dá)呈組織特異性,可能與轉(zhuǎn)錄因子類型及其功能發(fā)揮有關(guān),但這需要進(jìn)一步深入研究。
[1] Christenson L K,F(xiàn)arley D B,Anderson L H,et al. Luteal maintenance during early pregnancy in the pig:role for prostaglandin E2[J]. Prostaglandins,1994,47(1):61-75.
[2] Kowalczyk A E,Kaczmarek M M,Schams D,et al. Effect of prostaglandin E2 and tumor necrosis factor alpha on the VEGF-receptor system expression in cultured porcine luteal cells[J]. Mol Reprod Dev,2008,75(10):1558-1566.
[3] Ziecik A J. Old,new and the newest concepts of inhibition of luteolysis during early pregnancy in pig[J]. Domest Anim Endocrinol,2002,23 (1-2):265-275.
[4] Gadsby J E,Lovdal J A,Britt J H,et al. Prostaglandin F2 alpha receptor concentrations in corpora lutea of cycling,pregnant,and pseudopregnant pigs[J]. Biology of Reproduction,1993,49(3):604-608.
[5] Bazer F W,Thatcher W W,Matinat-Botte F,et al. Composition of uterine flushings from Large White and prolific Chinese Meishan gilts[J]. Reprod Fertil Dev,1991,3(1):51-60.
[6] Waclawik A,Jabbour H N,Blitek A,et al. Estradiol-17beta,prostaglandin E2(PGE2),and the PGE2 receptor are involved in PGE2positive feedback loop in the porcine endometrium[J]. Endocrinology,2009,150(8):3823-3832.
[7] Shen J,Zhou C,Zhu S,et al. Comparative transcriptome analysis reveals early pregnancyspecific genes expressed in peripheral blood of pregnant sows[J]. PLoS One,2014,9(12):e114036.
[8] Forrest G L,Gonzalez B. Carbonyl reductase[J]. Chem Biol Interact,2000,129(1-2):21-40.
[9] Forrest G L,Gonzalez B,Tseng W,et al. Human carbonyl reductase overexpression in the heart advances the development of doxorubicin-induced cardiotoxicity in transgenic mice[J]. Cancer Res,2000,60(18):5158-5164.
[10] Lakhman S S,Chen X,Gonzalez-Covarrubias V,et al. Functional characterization of the promoter of human carbonyl reductase 1(CBR1). Role of XRE elements in mediating the induction of CBR1 by ligands of the aryl hydrocarbon receptor [J]. Mol Pharmacol,2007,72(3):734-743.
[11] Wang S,Li J,Zhang A,et al. Selection of reference genes for studies of porcine endometrial gene expression on gestational day 12[J]. Biochem Biophys Res Commun,2011,408(2):265-268.
[12] King A E,Critchley H,OKelly R W. The NF-kappaB pathway in human endometrium and first trimester decidua[J]. Mol Hum Reprod,2001,7 (2):175-183.
[13] Nakamura H,Kimura T,Ogita K,et al. Alteration of the timing of implantation by in vivo gene transfer:delay of implantation by suppression of nuclear factor kappaB activity and partial rescue by leukemia inhibitory factor[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,321(4):886-892.
[14] Ross J W,Ashworth M D,Mathew D,et al. Activation of the transcription factor,nuclear factor kappa-B,during the estrous cycle and early pregnancy in the pig[J]. Reprod Biol Endocrinol,2010,8:39.
[15] Cheng Q,Sanborn C,F(xiàn)erguson D,et al. DNA sequence variants in the carbonyl reductase 1 (cbr1)gene in seven breeds of Canis lupus familiaris[J]. Genet Mol Res,2012,11(2):1109-1116.
[16] 劉珊. 人類羰基還原酶基因CBR1和DCXR的克隆及其編碼蛋白的功能研究[D]. 上海:復(fù)旦大學(xué),2004.
(責(zé)任編輯 崔建勛)
Cloning and expression of porcine carbonyl reductase1(CBR1) gene
ZHANG Ai-ling1,2,SUN Xian-yue2,YIN Qi3,LI Jia-qi2,ZHANG Hao2
(1. Biology and Food Engineering Institute,Guangdong University of Education/Guangdong Development Center of Applied Ecology and Ecological Engineering in Universities,Guangzhou 510303,China;2. College of Animal Science,South China Agricultural University/ Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding,Guangzhou 510642,China;3. Guangdong Wen’s Food Group Limited Company,Yunfu 527400,China)
The promoter,exons and introns of porcine carbonyl reductase1 gene (CBR1) were cloned,and the structure of CBR1 protein was analyzed. The similarity of amino acid was compared with other species and the phylogen of the gene was constructed. The tissues expression of the gene was detected by RT-PCR. The results showed that the promoter of the gene contained 2 875 bp,and typical binding sites of NFκB were predicted. The gene included three exons and two introns,and the formers spanned 289,108 and 437 bp,respectively. The two introns spanned 572 bp and 3 219 bp,respectively. The 5′UTR of 107 bp and 3′UTR of 242 bp were identified. The CDS was encoded by 289 amino acids. The CBR1 protein was hydrophilic,and contained two transmembranedomains but no signal peptide was found. The tertiary structure of the protein was formed by seven α-helixes,seven sheets,and loops. The amino acid sequence of the gene exhibited higher similarity of 84.48% with that of human and sheep. The CBR1 mRNA in the endometrium of Erhualian sows was higher significantly than that of Landrace × large white sows on GD12 (gestation day 12) (P<0.01). The gene was expressed with the highest level in kidney tissue and the higher in liver and small bowel tissues of Erhualian on GD12.
pig;CBR1;gene expression;promoter
S813.3;Q786
A
1004-874X(2016)08-0151-07
2016-04-13
國家自然科學(xué)基金(31201771);國家科技支撐計劃項目(2011BAD28B01);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-36)
張愛玲(1977-),女,博士,講師,E-mail:zhangmeixiaL@163.com
張豪(1965-),男,博士,教授,E-mail:zhanghao@scau.edu.cn