萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1基因克隆及其序列分析與原核表達(dá)

高 寒，夏 斌，費(fèi)小雯，李亞軍，鄧曉東，余麗蕓（.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 69；.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?570；.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院，海南 ?？?570）

萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1基因克隆及其序列分析與原核表達(dá)

高 寒1，2，夏 斌2，費(fèi)小雯3，李亞軍2，鄧曉東2，余麗蕓1
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；3.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院，海南 ?？?571101）

克隆萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的CrPGP3和CrFAT1基因，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)。選取萊茵衣藻CC124提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR獲得CrPGP3和CrFAT1的全長編碼區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體CrPGP3-PGEX-6p-1和CrFAT1-PGEX-6p-1，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DL21 （DE3）中，在37℃、1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)整合蛋白表達(dá)。結(jié)果表明， CrPGP3和CrFAT1的全長編碼區(qū)分別為786 bp和1 188 bp，分別編碼261和395個(gè)氨基酸；CrPGP3是與脂類合成相關(guān)磷脂酰甘油磷酸合成酶（Phosphatidylglycerophosphate synthase）屬于CDP-alcohol phosphatidyltransferase家族，CrFAT1是?；d體蛋白硫脂酶（Acyl-ACP thioesterase）屬于hot dog家族；SDS-PAGE結(jié)果表明所表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致。本文成功克隆了CrPGP3和CrFAT1基因的全長編碼區(qū)，并在原核生物中表達(dá)得到了預(yù)期蛋白。

CrPGP3；CrFAT1；萊茵衣藻；基因克??；原核表達(dá)

高寒，夏斌，費(fèi)小雯，等. 萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1基因克隆及其序列分析與原核表達(dá)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43 （8）：163-168.

萊茵衣藻是一類利用光合作用的自養(yǎng)生物，具有陸地、海洋分布廣泛，營養(yǎng)豐富、生長周期短、生物產(chǎn)量高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是開發(fā)新生物質(zhì)能源的理想材料［1-2］。光合作用對于藻的生長至關(guān)重要，也決定著藻類代謝產(chǎn)物的積累，磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）是植物在葉綠體中合成的磷脂，其在植物的光合作用中扮演著重要角色，而酰甘油磷酸合成酶（Phosphatidyl glycerophos phate synthase，PGPS）參與了PG合成的最后一步，對植物的生長和光合作用的活性有一定的影響［3-5］。通過將相關(guān)PGPS基因的敲除發(fā)現(xiàn)，PGPS基因的缺失對光合作用產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響［6-8］。也有研究表明PGP基因?qū)τ跀M南芥葉綠體分化也起到重要作用［7］。?；d體蛋白硫脂酶（Acyl-ACP thioesterase）是游離脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，它的參與直接決定了脂肪酸的產(chǎn)量和成分，在脂肪酸合成中具有重要作用［9-10］。不同?；d體蛋白硫脂酶的數(shù)量和成分會對脂肪酸積累造成影響［11］。如今生物柴油等生物燃料已經(jīng)是全世界的熱門話題，而脂肪酸的積累則對于生物質(zhì)油的產(chǎn)量至關(guān)重要［12-13］。本研究通過對兩基因的生物信息分析及其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能進(jìn)行預(yù)測，為今后其功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為萊茵衣藻CC124購自中國科學(xué)院水生生物研究所。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α和BL21兩種菌株購置于上海生工生物工程有限公司?？寺≥d體PMD18-T購自Takara公司，原核表達(dá)載體、過量表達(dá)載體和亞細(xì)胞定位載體為作者實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：Trizol試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糧凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript? Reverse Transcriptase、RNase 抑制劑、T4DNA連接酶、DL2000 Marker、DL15000 Marker、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ、SYBR ? Premix Ex Taq?（TakaRa）購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)proteinRule ?IV購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。氯仿、異戊醇等為分析純試劑。

儀器：恒溫恒濕培養(yǎng)箱（賽福PRX-250B，寧波）；冷凍調(diào)整離心機(jī)（eppendorf 5804R，德國）；PCR儀（Biometra Tgradient T1 德國）；干式恒溫器（奧盛 MK-20，杭州）；電泳儀（PowerPac? HC，新加坡）

培養(yǎng)基：培養(yǎng)萊茵衣藻所用的培養(yǎng)基是TAP培養(yǎng)基。大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和氯化鈉10 g/L。固體培養(yǎng)基則添加1.5%的瓊脂。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1CrPGP3和CrFAT1基因的PCR擴(kuò)增 總RNA的提取采用Trizol法［14］抽提，并用超微量分光光度計(jì)、1%瓊脂糖凝膠電泳參考反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript? Reverse Transcriptaser的使用說明以O(shè)ligo（dT）18為引物，以1 μg總RNA為模板合成cDNA。根據(jù)Phytozome 11 （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）Chlamydomonas reinhardtii v5.5數(shù)據(jù)庫中的序列信息（CrPGP3：Cre02.g095106.t1.1 CrFAT1：Cre06.g256750.t1.2），分別設(shè)計(jì)兩對RT-PCR擴(kuò)增引物（表1），并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：滅菌 ddH2O 水稀釋10×的 cDNA 1 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4μL，10× LA Taq buffer 2.5μL，LA Taq 酶0.3 μL，5 mol/L 甜菜堿2.5 μL，DMSO 1μL，滅菌 ddH2O 15.3μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min，然后按95℃變性45s，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，3個(gè)反應(yīng)循環(huán)30次；最后72℃延伸 10 min；4℃結(jié)束。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，連接到pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，菌液PCR鑒定，送至上海生工生物工程有限公司測序。

表1　CrPGP3 和 CrFAT1基因PCR擴(kuò)增引物信息

1.2.2序列分析方法 在phytozome網(wǎng)站找到基因的DNA序列和cDNA序列，然后分別輸入NCBI的Spidey分析工具（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/），分析外顯子和內(nèi)含子數(shù)目，并用DNAMAN軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖；利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ExPASy-ProtParam tool （http：//web.expasy. org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測；利用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/）進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。

1.2.3CrPGP3和CrFAT1原核表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)兩對引物：GEX CrPGP3正反向引物、GEX CrFAT1正反向引物，序列信息見表1，分別在CrPGP3和CrFAT1編碼區(qū)序列的兩端引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，用LA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后的PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pGEX-6p-1分別利用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切。目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收，并用T4 DNA連接酶在16℃連接8h，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽性克隆經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，送到上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4CrPGP3和CrFAT1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 吸取50 μL含重組質(zhì)粒的DH5α菌液至50 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200 r/min下振蕩過夜培養(yǎng)，吸取過夜培養(yǎng)物1 mL加入到10 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200 r/min下振蕩培養(yǎng)2 h，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，在37℃，200 r/min下誘導(dǎo)培養(yǎng)，于培養(yǎng)2、4、6 h分別收集處理組和對照組誘導(dǎo)物1 mL，12 000 r/min，4℃離心1 min，棄上清，用100 μL的1×SDS凝膠加樣緩沖液重懸菌體沉淀，100℃加熱3 min，12 000 r/min，4℃離心1 min，每種懸液取10 μL進(jìn)行15%SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)對凝膠進(jìn)行染色，再對凝膠條帶進(jìn)行掃描。

2　結(jié)果與分析

2.1萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1基因全長cDNA分析 PCR獲得的基因中間片段經(jīng)過測序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)與Chlamydomonas reinhardtii v5.5數(shù)據(jù)庫中的序列信息完全匹配，將中間片段與3′端和5′端進(jìn)行拼接，獲得CrPGP3和CrFAT1基因的全長。CrPGP3的cDNA序列全長為1 853 bp，開放閱讀框（ORF）長786 bp，編碼261個(gè)氨基酸，其基因區(qū)的DNA序列長4 423 bp，包含7個(gè)內(nèi)含子，8個(gè)外顯子（圖1A黑色方形）。CrFAT1的cDNA序列全長為2 362 bp，ORF長1 188 bp，編碼395個(gè)氨基酸，其基因區(qū)的DNA序列長4 692 bp，包含6個(gè)內(nèi)含子，7個(gè)外顯子（圖1B黑色方形）。

圖1　CrPGP3和CrFAT1基因的結(jié)構(gòu)

將兩基因的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對比，分析其氨基酸在其他物種中的同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CrPGP3氨基酸序列為CDP-alcohol phosphatidyltransferase家族，CrFAT1氨基酸序列為hot_dog 家族，兩者與團(tuán)藻（Volvox carteri f. nagariensis）的相關(guān)氨基酸序列相似度均為98%以上，與小球藻（Chlorella variabilis）、綠藻（Coccomyxa subellipsoidea C-169）都具有很高的同源性。利用MEGA5對兩者氨基酸進(jìn)行NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。從圖2可以看出，不同科屬類植物之間相關(guān)基因有明顯差異。CrPGP3和CrFAT1都與團(tuán)藻的進(jìn)化關(guān)系最為親近，然后與藍(lán)藻（Monoraphidium neglectum）、綠藻、小球藻等在同一分枝。高等植物如煙草（Nicotiana tomentosiformis）、番茄（Solanum lycopersicum）、油菜（Brassica napus）、向日葵（Helianthus annuus）等都在另一個(gè)分枝，表明萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1與高等植物同源基因之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2　CrPGP3和CrFAT1氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.1.2蛋白基本理化性質(zhì)，磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測與分析 用ExPASy-ProtParam在線分析軟件預(yù)測CrPGP3和CrFAT1基因所編碼的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明CrPGP3所編碼的蛋白包含261個(gè)氨基酸，分子量為28.7 kDa，理論等電點(diǎn)pI為9.06，預(yù)測分子式為C1351H2107N331O343S8，不穩(wěn)定系數(shù)為49.44，總平均親水系數(shù)（GRAVY）為0.561，推測CrPGP3蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。CrFAT1蛋白包含395個(gè)氨基酸，分子量約為44.4kDa，理論等電點(diǎn)pI為8.42，預(yù)測分子式為C1894H3014N556O575S19，不穩(wěn)定系數(shù)為58.71，總平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.351，推測CrFAT1所編碼的蛋白為不穩(wěn)定疏水蛋白。

通過NetPhos 2.0 Server在線分析兩基因所編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)結(jié)果顯示：CrPGP3基因所編碼的蛋白可發(fā)生磷酸化位點(diǎn)有7個(gè)：包括7、26、29、95位點(diǎn)的絲氨酸（Ser）和11、85位點(diǎn)的蘇氨酸（Thr），以及99位點(diǎn)的酪氨酸（Tyr）。CrFAT1基因所編碼的蛋白可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有16個(gè)，包括10個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)，各自分別在肽鏈第16、19、20、23、36、49、141、213、290位，第6、17、109、240、372、373位。

2.2原核表達(dá)載體構(gòu)建和重組質(zhì)粒鑒定

利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ分別對重組質(zhì)粒CrPGP3-Pgex-6p-1和CrFAT1-pGEX-6p-1進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖3，重組質(zhì)粒CrPGP3-PGEX-6p-1在5 000 bp左右和750 bp左右的位置上各出現(xiàn)一條亮帶，同樣重組質(zhì)粒CrFAT1-pGEX-6p-1也分別在5 000 bp左右和1 000 bp以上的位置上出現(xiàn)一條亮帶，重組質(zhì)粒中目的基因的測序結(jié)果與目的片段大小一致，表明萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3　重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

2.3CrPGP3 和CrFAT1蛋白原核表達(dá)檢測

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21宿主菌中，篩選陽性單克隆，在37℃條件下利用IPTG誘導(dǎo)時(shí)間分別為2、4、6 h表達(dá)外源蛋白，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，其電泳結(jié)果如圖4。插有外源片段的重組質(zhì)粒CrPGP3-PGEX-6p-1經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期的蛋白分子量50 kD左右有1條蛋白條帶（圖4A），空載體轉(zhuǎn)化子在26 kD左右有1條蛋白條帶；重組質(zhì)粒CrFAT1-pGEX-6p-1在70 kD左右出現(xiàn)1條蛋白條帶（圖4B），空載體轉(zhuǎn)化子同樣在26 kD左右出現(xiàn)1條蛋白條帶，經(jīng)過計(jì)算重組質(zhì)粒CrPGP3-pGEX-6p-1和CrFAT1-pGEX-6p-1所表達(dá)的融合蛋白大小約與預(yù)期蛋白大小相符，表明重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)了其相應(yīng)所編碼的蛋白。不同的誘導(dǎo)時(shí)間會影響蛋白的表達(dá)量，兩個(gè)重組質(zhì)粒約在IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，蛋白表達(dá)量最多。

圖4　CrPGP3（A） 和CrFAT1（B）在大腸桿菌中表達(dá) SDS-PAGE 分析

3　結(jié)論與討論

萊茵衣藻是單細(xì)胞真核生物，作為真核模式生物，其基因組測序已經(jīng)基本完成，是一種重要的油料作物，萊茵衣藻體形小、繁殖快，光合效率高，培養(yǎng)條件簡單，被稱為“光合酵母”［15］，是生產(chǎn)生物質(zhì)能源的熱門材料。通過對萊茵衣藻與光合作用相關(guān)和脂肪酸代謝相關(guān)基因的研究，對于生物質(zhì)能源的產(chǎn)物具有重要研究意義。

通過對萊茵衣藻CrPGP3、CrFAT1氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析顯示，萊茵衣藻與團(tuán)藻具有很高的同源性。如與團(tuán)藻序列的相似度達(dá)到了98%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中，團(tuán)藻與萊茵衣藻以100匹配度同在一個(gè)分支中，與小球藻、綠藻在一個(gè)大分支中，但是與高等生物如煙草，番茄親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本試驗(yàn)成功將萊茵衣藻CrPGP3和CrFAT1全長編碼區(qū)克隆到pGEX-6p-1表達(dá)載體上并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，表達(dá)出蛋白大小分別約為50、70 kDa的融合蛋白，pGEX-6p-1作為融合蛋白的一部分，可表達(dá)大小26 kDa蛋白。通過計(jì)算，目的蛋白大小與預(yù)測蛋白大小相符。對于下一步純化蛋白以及進(jìn)行生物功能分析奠定基礎(chǔ)。CrPGP3編碼酰甘油磷酸合成酶，是參與光合作用的重要酶，對于萊茵衣藻的生長，代謝產(chǎn)物都具有深遠(yuǎn)影響。CrFAT1是編碼?；d體蛋白硫脂酶的基因，通過對此類酶的研究，闡明與脂肪酸代謝的關(guān)系，進(jìn)而對藻類產(chǎn)油新類型能源奠定了基礎(chǔ)，為解決能源危機(jī)做出了貢獻(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Cloning，sequence analysis，and prokaryotic expression of Chlamydomonas reinhardtii gene CrPGP3 and CrFAT1

GAO Han1，2，XIA Bin2，F(xiàn)EI Xiao-wen3，LI Ya-jun2，DENG Xiao-dong2，YU Li-yun1
（1.College of Life Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical
Agicultural Sciences，Haikou 571101，China；3.Department of Basic Medicine，Hainan Medical College，Haikou 571101，China）

In order to express the CrPGP3 and CrFAT1 genes of Chlamydomonas reinhardtii in prokaryotic cell，we cloned and analyzed these two sequences. After the total RNA in C. reinhardtii CC124 was extracted，the revers transcription were performed. The full length cDNA obtained by PCR was inserted into the prokaryotic expression vector PGEX-6p-1 and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）. These positive clones were called CrPGP3-PGEX-6p-1 and CrFAT1-PGEX-6p-1. The target proteins were expressed after adding 1.0 mmol/L IPTG. The results showed that the CrPGP3 and CrFAT1 gene had 786 bp and 1 188 bp coding 261 and 395 amino acids，respectively. Sequence analysis indicated that CrPGP3 was a member of super family “CDP-alcohol phosphatidyltransferase”，and the CrFAT1 belonged to a member of “hot dog” super family. The SDS-PAGEdisplayed that the expressed proteins were consistent with the anticipated size. The recombinant plasmids expressed the target proteins in E. coli BL21.

CrPGP3；CrFAT1；Chlamydomonas reinhardtii；gene clone；prokaryotic expression

Q945

A

1004-874X（2016）08-0163-06

2016-02-28

國家自然科學(xué)基金（31360051，31160050）；海南省重大科技專項(xiàng)（ZDZX2013023）；海南省工程技術(shù)研究中心專項(xiàng)（GCZX2012004，GCZX2013004）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（ITBB）

高寒（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：hanksg@foxmail.com

余麗蕓（1966-），女，博士，教授，E-mail：yuliyun1227@126.com