健脾清化中藥復(fù)方對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎TLR4-MyD88依賴途徑蛋白表達(dá)及TNF-α的影響

黃銘涵，黃　健，陳　琴，李思漢，林建龍，鐘國(guó)棟，黃恒青，林　平

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州　350003；2.福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省婦幼保健院；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州　350001；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，福建 福州　350108)

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◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

健脾清化中藥復(fù)方對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎TLR4-MyD88依賴途徑蛋白表達(dá)及TNF-α的影響

黃銘涵1，黃健2，陳琴3，李思漢4，林建龍1，鐘國(guó)棟1，黃恒青1，林平1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省婦幼保健院；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州350001；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，福建 福州350108)

目的觀察健脾清化中藥復(fù)方對(duì)慢性萎縮性胃炎(CAG)大鼠TLR4及下游MyD88依賴途徑相關(guān)蛋白表達(dá)及炎性因子TNF-α的影響，探討健脾清化中藥復(fù)方治療CAG的分子機(jī)制。方法將53只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組8只和CAG造模組45只，以“氨水+去氧膽酸鈉+乙醇”法復(fù)制CAG大鼠模型。確認(rèn)造模成功后，將造模組余下40只CAG大鼠隨機(jī)分為模型組、維酶素組、中藥低、中、高劑量組，各8只。各組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)30 d。HE染色觀察病理組織學(xué)改變，Western blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2的蛋白表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α含量。結(jié)果模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，血清TNF-α含量明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，健脾清化中藥復(fù)方低、中、高劑量組胃黏膜病變明顯改善，TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05或P<0.01)，血清TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論健脾清化中藥復(fù)方可有效改善CAG大鼠胃黏膜組織病理改變，其治療機(jī)制可能與降低組織中TLR4-MyD88依賴途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)，以及抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

健脾清化中藥復(fù)方；慢性萎縮性胃炎；胃黏膜病理；TLR4-MyD88依賴途徑；TNF-α；大鼠

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是由多種病因引起的胃黏膜慢性炎癥病變，以胃黏膜變薄、黏膜固有腺體萎縮、胃酸分泌功能減少為其病理特點(diǎn)，常伴腸上皮化生及假幽門腺化生[1-2]。阻斷或延緩CAG進(jìn)展，對(duì)預(yù)防胃癌發(fā)生具有十分重要的意義。我們之前臨床研究證實(shí)，健脾清化中藥復(fù)方能有效逆轉(zhuǎn)CAG患者胃黏膜腺體萎縮[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜組織中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)及其下游MyD88依賴途徑，在CAG的發(fā)病過程中扮演了重要的角色[4-5]。本研究通過建立CAG大鼠模型，分析健脾清化中藥復(fù)方對(duì)CAG大鼠胃黏膜組織學(xué)、TLR4及其下游MyD88依賴通路重要分子MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)量，以及炎性因子TNF-α的影響，探討健脾清化中藥復(fù)方干預(yù)CAG的作用機(jī)制。

1　材料

1.1動(dòng)物53只健康SPF級(jí)Wistar大鼠，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(滬)：0164377，2012-0002，體質(zhì)量(110±10) g，♂，4周齡。

1.2藥物健脾清化中藥復(fù)方(閩藥制字Z05104030)藥物組成：白扁豆220 g、茯苓220 g、薏苡仁220 g、茵陳110 g、佩蘭66 g、白豆蔻33 g、黃連33 g、厚樸66 g、赤芍110 g，煎液濾過濃縮至500 mL，滅菌瓶裝。由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥劑室提供。維酶素片(北海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H45021183，產(chǎn)品批號(hào)：121020)。

1.3主要試劑與儀器小鼠抗大鼠TLR4(Santa Cruz，sc-293072)，小鼠抗大鼠MyD88(Santa Cruz，sc-8197)，小鼠抗大鼠NF-κB(Santa Cruz，sc-373)，小鼠抗大鼠COX-2(Santa Cruz，sc-23984)，小鼠抗大鼠β-actin(R&D，937215)，HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(北京中杉)。大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)。Primo R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher)；Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽(Bio-rad)；Mini Trans-BLot小型轉(zhuǎn)印槽(Bio-rad)；Dolphin-Chemi凝膠成像系統(tǒng)(WEALTEC)；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(Thermo公司)；圖像分析軟件(Quantity One Software)；高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2　方法

2.1分組與造模按隨機(jī)數(shù)字表法，將53只Wistar大鼠分為空白組8只，CAG造模組45只?？瞻捉M大鼠在正常飼養(yǎng)環(huán)境中，正常飲用水以及正常飼料飲食。CAG造模方法參照文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)：正常飼料飲食，以0.5 g·L-1氨水作為飲用水自由飲用，20 mmol·L-1去氧膽酸鈉溶液每日灌胃1次，每次2 mL，60%乙醇每周空腹灌胃2次，每次2 mL，造模時(shí)間為12周。12周末，造模組隨機(jī)處死3只大鼠，取胃組織行病理檢查。在判斷CAG造模成功后，剔除造模組死亡及隨機(jī)處死的大鼠共計(jì)5只，將余下造模成功的40只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組8只，維酶素組8只，中藥低、中、高劑量組各8只。

2.2給藥方法與標(biāo)本采集依據(jù)臨床應(yīng)用劑量換算成大鼠給藥劑量，低、中、高劑量組分別按1.5、3.0、6.0 mL·kg-1·d-1劑量灌胃。維酶素組予維酶素0.3 g·kg-1·d-1灌胃。根據(jù)大鼠體重將藥液用生理鹽水稀釋至每次4 mL?？瞻捉M及CAG模型對(duì)照組給予每次4 mL生理鹽水灌胃。灌胃共30 d。藥物干預(yù)結(jié)束后，禁食24 h，經(jīng)麻醉處死后開腹，腹主動(dòng)脈取血3 mL。取胃后沿胃大彎剪開，以生理鹽水清洗胃黏膜表面，展平觀察胃黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、色澤。于胃竇部剪取黃豆大組織2塊，立即放入液氮中凍存，余下的胃竇部組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中。

2.3HE染色評(píng)價(jià)大鼠胃竇部病理組織學(xué)改變4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片5張，片厚4 μm，HE染色，光鏡下觀察各組病理切片胃黏膜形態(tài)變化。

2.4Western blot法檢測(cè)大鼠胃竇部TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)量取150 mg胃竇部組織，經(jīng)蛋白裂解后取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，TBST封閉1 h，分別用抗TLR4(1 ∶800)、MYD88(1 ∶500)、NF-κB(1 ∶1 000)、COX-2(1 ∶800)、β-actin(1 ∶1 000)的一抗4℃過夜，TBST洗3次；二抗室溫孵育1 h。增強(qiáng)的化學(xué)熒光素顯像并攝片，以Quantity One Software進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目標(biāo)條帶與內(nèi)參(β-actin)灰度的比值。

2.5ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α含量將大鼠全血3 mL低溫冷凍離心，4℃，3 500 r·min-1×15 min，取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定步驟進(jìn)行操作。

3　結(jié)果

3.1大鼠死亡情況空白組大鼠實(shí)驗(yàn)期間均全部存活。造模組大鼠造模后期死亡2只，中藥各劑量干預(yù)組大鼠治療期間無(wú)死亡，模型組大鼠治療期間死亡1只。病理解剖取材可見胃黏膜固有層腺體數(shù)量減少，萎縮變薄，有合并異型增生、輕度腸上皮化生。

3.2干預(yù)后各組大鼠胃組織病理變化比較空白組大鼠胃上皮細(xì)胞排列整齊，腺體形態(tài)規(guī)則，黏膜厚度正常，細(xì)胞呈單層柱狀，腺上皮與腺管分界清楚。固有腺及黏膜層毛細(xì)血管無(wú)擴(kuò)張，黏膜肌層未見增生及向黏膜層伸入。模型組大鼠見胃黏膜不同程度的萎縮，固有層腺體減少，排列不規(guī)則，可伴有不同程度的腸上皮化生及異型增生。中藥低、中、高劑量組及維酶素組較模型組有不同程度的改善，以中藥高劑量組改善為優(yōu)，鏡下見胃黏膜腺體排列較整齊，數(shù)量增多，固有層單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量少。見Fig 1。

Fig 1　Pathological images of rat gastric mucosal tissue(×200)

A：Blank group；B：Model group；C：Vitacoenzyme-tablet group；D：Low dose of JQCC group；E：Medium dose of JQCC group；F：High dose of JQCC group

3.3干預(yù)后各組TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)量的比較各組灰度值比較顯示，與空白組相比，造模后模型組TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)量均明顯增高(P<0.01)。藥物干預(yù)后同模型組比較，不同劑量中藥組及維酶素組蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)，特別以中藥高劑量組表現(xiàn)明顯。見Fig 2、Tab 1。

Fig 2　Expression quantities of TLR4,MyD88,NF-κB,COX-2 from gastric mucosa of rats by Western-blot

A：Blank group;B：Model group;C：Vitacoenzyme-tablet group;D：Low dose of JQCC group;E：Medium dose of JQCC group;F：High dose of JQCC group

3.4干預(yù)后各組血清炎癥因子TNF-α變化的比較與空白組比較，造模后模型組血清中TNF-α濃度明顯增高(P<0.01)。同模型組比較，中藥高、中、低劑量組及維酶素組血清中TNF-α濃度均降低(P<0.05或P<0.01)，且中藥高劑量組降低更為明顯(P<0.01)。見Tab 2。

4　討論

CAG臨床上以上腹悶脹痛、反酸、食欲減低等為主要表現(xiàn)，已被列為胃癌的癌前疾病[1]。在CAG發(fā)病過程中，TLRs及下游信號(hào)通路的激活與CAG病情進(jìn)展高度相關(guān)[5]。TLR4是TLRs家族成員中識(shí)別內(nèi)源性以及外源性配體的最主要受體，其下游通路包括MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑[7]。其中MyD88依賴途徑是TLR4激活后的主要通路，以啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的方式介導(dǎo)下游更為廣泛的炎性反應(yīng)[8]。通常情況下，NF-κB以同型或異型二聚體形式存在于胞質(zhì)，與它的抑制蛋白(IκB)結(jié)合在一起。TLRs通路激活可解除NF-κB與IκB的結(jié)合，使NF-κB獲自由，從胞質(zhì)移入胞核內(nèi)，與靶基因上特定的序列結(jié)合，引起炎性因子的釋放，參與了胃黏膜損傷及病變進(jìn)展[4]。COX-2(cyclooxygenase-2)是前列腺素合成的限速酶，與組織損傷、修復(fù)、癌變密切相關(guān)。在COX-2基因的上游存在NF-κB的作用位點(diǎn)，在NF-κB的作用下COX-2表達(dá)增加[9]。Hong等[10]的研究表明，COX-2表達(dá)強(qiáng)度在淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典

Tab 1　Comparison of expression quantities of TLR4,MyD88,NF-κB,COX-2 protein from gastric mucosal ±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel；##P<0.01vsvitacoenzyme

Tab 2　Comparison of variations of TNF-α from serum inflammatory ±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel

型增生以及胃癌中呈遞增趨勢(shì)，提示COX-2的高表達(dá)是胃黏膜癌變過程中早期事件且與預(yù)后相關(guān)。TNF-α是特異性免疫應(yīng)答與炎性反應(yīng)之間的一種重要介質(zhì)[11]，可以趨化、激活炎性細(xì)胞并使其定位于病變胃黏膜，最終導(dǎo)致胃黏膜組織的炎癥和萎縮[12]。NF-κB可以上調(diào)TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄，升高的TNF-α可正反饋再次激活NF-κB，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致最初的炎性信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大[12]。

健脾清化中藥復(fù)方由白扁豆、茯苓、薏苡仁、茵陳、佩蘭、白豆蔻、黃連、厚樸、赤芍組成，目前已被國(guó)家中醫(yī)藥管理局十一五脾胃重點(diǎn)?？撇杉{，作為CAG協(xié)定處方應(yīng)用推廣。我們之前的臨床研究證實(shí)[3]，健脾清化中藥復(fù)方對(duì)CAG患者上腹疼痛、上腹悶脹、食欲減低等癥狀有明顯療效，并可明顯逆轉(zhuǎn)胃黏膜組織病理。在本研究中，模型組胃組織中TLR4、MyD88、NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)量明顯增高，血清中TNF-α濃度升高，證實(shí)TLR4/MyD88依賴途徑的激活參與了CAG的發(fā)病過程；經(jīng)健脾清化中藥復(fù)方治療后，胃黏膜萎縮程度改善，且胃組織中TLR4/MyD88依賴途徑上的蛋白表達(dá)量以及血清中TNF-α濃度均明顯下降，提示健脾清化中藥復(fù)方可能通過抑制TLR4/MyD88的持續(xù)活化發(fā)揮治療作用。同時(shí)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中也觀察到，中藥高劑量組對(duì)胃黏膜病變的改善更為明顯，對(duì)TLR4/MyD88通路的抑制更為明顯。

因此我們認(rèn)為，抑制TLR4/MyD88依賴途徑的持續(xù)活化，是CAG藥物治療的一個(gè)新思路。本研究為進(jìn)一步研究中藥干預(yù)對(duì)MyD88依賴途徑下游靶基因和下游分子的調(diào)控機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

(致謝：本研究在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心、福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院完成。衷心感謝動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心謝金東老師、福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院方翌、張鈴實(shí)驗(yàn)師的幫忙。)

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Effects of Jianpi Qinghua Chinese herbal compound on TLR4-MyD88-dependent pathway protein expression and TNF-α in animal model of chronic atrophic gastritis(CAG) in rats

HUANG Ming-han1, HUANG Jian2, CHEN Qing3, LI Si-han4,LIN Jian-long1, ZHONG Guo-dong1, HUANG Heng-qing1, LIN Ping1

(1.TheSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350003,China;2.DeptofGynaecologyandObstetrics，F(xiàn)ujianMedicalUniversityTeachingHospital，F(xiàn)ujianMaternityandChildHealthHospital，F(xiàn)uzhou350001，China;3.XieheHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;4.DeptofPostgraduates,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350108,China)

AimTo investigate Jianpi Qinghua Chinese herbal compound(JQCC) on the expressions of the relevant proteins of TLR4 and its downstream MyD88-dependent pathways, and on the inflammatory factor TNF-α in the animal model of chronic atrophic gastritis(CAG) in rats, so as to discuss the molecular mechanism of JQCC in the treatment of CAG. Methods53 Wistar rats were randomly divided into the blank control group(n=8) and the CAG model group(n=45), and the animal model of CAG in rats was replicated by the “ammonia+sodium deoxycholic acid+ethanol” method. After the successful modeling was confirmed, the rest of the 40 CAG rats in the CAG model group were divided into the model group, the vitacoenzyme-tablet group, the low dose of JQCC group, the medium dose of JQCC group, the high dose of JQCC group(each groupn=8).The experimental animals of all the groups were given intragastric administration of medication continuously for 30 days. Then the pathological histological changes were observed by HE staining. The protein expressions of TLR4, MyD88, NF-КB and COX-2 were tested by Western-blot assay. And the serum TNF-α level was measured by ELISA.ResultsThe protein expressions of TLR4, MyD88, NF-КB and COX-2 and the serum TNF-α level in the rats in the model group were increased evidently(P<0.01). Compared with the model group, the gastric mucosa lesions were improved in the low dose of JQCC group, the medium dose of JQCC group, the high dose of JQCC group, together with significant decreases of the protein expressions of TLR4, MyD88, NF-κB and COX-2 and the serum TNF-α level(P<0.05 orP<0.01).ConclusionJQCC could effectively improve the pathological and histological changes in the gastric mucosa in CAG rats, and the therapeutic mechanism might be related to the expressions of the relevant proteins of TLR4-MyD88-dependent pathways and the expressions of anti-inflammatory cytokines.

Jianpi Qinghua Chinese herbal compound(JQCC); chronic atrophic gastritis; gastric mucosal pathology; TLR4-MyD88-dependent pathways; TNF-α；rats

2016-05-11,

2016-05-25

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No 2015Y0023)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 2015J01403)；福建省衛(wèi)計(jì)委青年科研項(xiàng)目(No 2013-1-10)；福建省衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)科研項(xiàng)目(No wzpw201305)；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(No JA15247)

黃銘涵(1978-)，男，主治醫(yī)師，研究方向：慢性萎縮性胃炎的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail：huangminghan2010@163.com；

林平(1961-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：慢性萎縮性胃炎的臨床與基礎(chǔ)研究，通訊作者，E-mail：plane97@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.026

A

1001-1978(2016)09-1321-05

R-332；R287； R289.5；R322.44；R573.320.22；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.052.html