特女貞苷對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

胡冬梅，陸　楊，房敏峰，王婧雯，文愛東

(1. 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西北大學生命科學學院，陜西 西安　710069；2.第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安　710032)

?

特女貞苷對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

胡冬梅1，2，陸楊2，房敏峰1，王婧雯2，文愛東2

(1. 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西北大學生命科學學院，陜西 西安710069；2.第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安710032)

目的研究中藥活性物質特女貞苷對四氯化碳(CCl4)誘發(fā)小鼠急性肝損傷的保護作用。方法采用小鼠腹腔注射CCl4制作急性肝損傷模型，測定小鼠血清中丙氨酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)以及小鼠肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等指標，并進行肝組織病理學檢查，考察特女貞苷對CCl4致急性肝損傷的保護作用。結果特女貞苷能明顯降低急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6含量(P<0.05，P<0.01)，明顯降低肝臟MDA含量(P<0.01)，增強肝臟SOD和GSH-Px活性(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，肝組織病理檢查結果也顯示其對肝損傷有明顯的改善作用。結論特女貞苷對CCl4引起的肝損傷有明顯的保護作用，其機制可能與其抗氧化及抗炎作用有關。

特女貞苷；CCl4；小鼠；急性肝損傷；抗氧化；抗炎；保肝

中藥女貞子(fructusligustrilucidi)為木樨科植物女貞(ligustrumlucidumAit)的干燥成熟果實，具有補腎滋陰，養(yǎng)肝明目的功效。女貞子中含有的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物為一類重要活性成分。藥理研究表明，環(huán)烯醚萜苷類成分具有保肝利膽、降血糖和血脂、解痙、抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用[1-2]。女貞子醇提物及其裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分能有效清除自由基，起到抗氧化保肝作用[3-5]。特女貞苷(specnuezhenide)是女貞子特征性活性成分，為女貞子裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類中含量較高的成分之一，現(xiàn)已作為2015版藥典女貞子質量控制的含量測定指標[6]。本實驗為了驗證特女貞苷單體物質的保肝活性，采用CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型，結合生化、ELISA指標和病理形態(tài)學觀察，確證特女貞苷的保肝作用，并探討其保肝作用的可能作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料昆明種♂小鼠，48只，體質量(18±22)g，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號:SCXK(軍)2012-007。小鼠常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水，實驗開始前適應性飼養(yǎng)1周。

特女貞苷(99.52%，15120101)購于成都普菲德生物技術有限公司；CCl4(20141107)為國產分析純，購于天津科貿化學試劑有限公司，臨用時用花生油配成0.5% CCl4溶液；水飛薊素(H20040299)購于天津天士力圣特制藥有限公司；ALT(20150456)、AST(20150456)、MDA(20150428)、GSH-Px(20150429)、SOD(20150430)、TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA(ISC20150EIA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2儀器電子天平(北京賽多利斯天平有限公司BS110S)，全波長酶標儀(美國THERMO，MULTISKAN GO)，高速離心機(德國艾本德，5804R)、超聲波清洗器(熊貓集團南京電子計量有限公司)，超低溫冰箱(上海Thermo公司，700Series，VP-SOOH)，電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-1)，倒置顯微鏡(日本奧林帕斯，IX71+DP72)。

2　方法

2.1動物分組及給藥昆明種♂小鼠48只，隨機分為6組：空白對照組，模型組，水飛薊素(陽性藥)組，特女貞苷低、中、高劑量組，每組8只。采用灌胃法給藥，每次給藥前試藥用雙蒸水配成所需濃度的溶液。水飛薊素組給予水飛薊素100 mg·kg-1；特女貞苷低、中、高劑量組分別給予特女貞苷50、100、200 mg·kg-1；空白對照組和模型組給予雙蒸水，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，模型組、水飛薊素組及特女貞苷各劑量組一次性腹腔注射0.5% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1，制作急性肝損傷模型，正常組腹腔注射等量花生油。造模后24 h，小鼠摘眼球法取血，分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)錂zALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6。取血后脫頸處死小鼠，剖腹，在肝臟右葉同一部位取一小塊肝臟組織，用10%的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色做病理檢查；另取一小塊肝臟組織，制成10%的肝勻漿，-80℃冰箱保存?zhèn)錅yMDA、SOD和GSH-Px。

2.2生化指標檢測按照試劑盒相應的說明書操作步驟測定小鼠血清ALT、AST水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA試劑盒)法測定小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平；硫代巴比妥酸法測定肝組織勻漿中MDA含量，考馬斯亮藍蛋白法測定肝組織勻漿中蛋白質含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸直接法測定肝組織勻漿中GSH-Px的活力。

3　結果

3.1對小鼠血清中ALT、AST的影響各組小鼠ALT、AST水平見Tab 1。由Tab 1可以看出，與空白對照組相比，模型組血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組相比，特女貞苷各劑量組血清ALT、AST水平均明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性，高劑量特女貞苷與水飛薊素的藥效相當，表明特女貞苷可以減輕CCl4所致小鼠急性肝損傷。

Tab 1　Effects of specnuezhenide on serum ALT and AST activities in mice with hepatic ±s，n=8)

**P<0.01vscontrol;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel

3.2對小鼠肝臟MDA、SOD和GSH-Px的影響各組小鼠MDA、SOD和GSH-Px活力見Tab 2。由Tab 2可以看出，模型組與空白對照組相比，肝臟MDA含量明顯增高，SOD和GSH-Px水平明顯降低(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組相比，特女貞苷各劑量組肝組織MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，SOD和GSH-Px活力明顯增高(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，高劑量組與水飛薊素組各個指標水平相當，結果表明特女貞苷可能具有一定的抗氧化作用。

3.3對小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的影響各組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6水平見Tab 3。由Tab 3可以看出，與空白對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明顯升高(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組相比，特女貞苷各劑量組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性，結果表明特女貞苷可能具有一定的抗炎作用，其作用機制可能通過抑制肝臟內的炎癥反應來起保肝作用。

3.4對肝損傷小鼠肝臟病理改變的影響Fig 1 HE染色顯示，空白對照組小鼠肝細胞正常排列，細胞質均勻，具有明顯的細胞核及核仁，中央靜脈清晰可見。模型組肝細胞結構嚴重破壞，部分細胞壞死，細胞核固縮，顆粒變性，中央靜脈周圍有大量炎性細胞浸潤。水飛薊素組及特女貞苷高劑量組肝細胞結構較為完整，少量炎性細胞，病理損傷情況較模型組明顯改善。與模型組相比，特女貞苷低及中劑量組在一定程度上減少了炎性細胞的浸潤、減輕肝細胞損傷程度，但效果不如水飛薊素組和特女貞苷高劑量組明顯。

4　討論

CCl4是經典的化學性肝毒劑，腹腔注射誘導小鼠肝損傷模型重現(xiàn)性好，既可以造成肝細胞實質性損傷(細胞變性和壞死)，又可以引起肝功能異常，能夠準確反映肝細胞的形態(tài)學變化。CCl4誘導肝損傷作用機制十分復雜,主要與脂質過氧化物有關，脂質過氧化物使細胞膜流動性降低，通透性增高，線粒體膜受損，細胞產能障礙，活性氧生成增多，造成細胞損傷[7]。肝細胞膜通透性增高，轉氨酶透過損傷細胞膜溢出，血清ALT和AST水平會有大幅度的升高[8]。所以血清中ALT、AST水平的高低在一定程度上反映了肝細胞受損的程度。因此選用ALT、AST指標來反映肝損傷情況。本研究中，模型組小鼠血清的ALT和AST水平較空白對照組明顯升高，水飛薊素組、特女貞苷各給藥組均能不同程度降低ALT、AST水平，后者對抗肝損傷作用呈劑量依賴性，表明特女貞苷有較好的保肝降酶作用。

Tab 2　Effects of specnuezhenide on MDA, SOD and GSH-Px content in mice with hepatic ±s，n=8)

**P<0.01vscontrol;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel

Tab 3　Effects of specnuezhenide on serum TNF-α, IL-1β and IL-6 activities in mice with hepatic ±s，n=8)

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel

Fig 1　Effects of specnuezhenide on liver histopathology change in mice with hepatic damage(×400)

A：Control; B：Model; C：Silymarin; D：Specnuezhenide(low); E：Specnuezhenide(middle); F：Specnuezhenide(high)

脂質過氧化反應是肝損傷發(fā)生的重要機制，SOD是體內清除自由基、抑制自由基反應的主要抗氧化酶，體內SOD活性越高，自由基清除的速度越快。肝細胞受到自由基攻擊時，SOD可因其過度消耗而減少，其活性降低則會導致體內氧自由基的積累，引發(fā)質膜的過氧化作用，使膜結構與功能受損，最終導致肝細胞的死亡[9]。GSH-Px是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，能特異性地清除機體活性氧，減輕和阻止活性氧的過氧化作用，是機體重要的抗氧化劑[10]。脂質過氧化的主要降解產物MDA可嚴重損傷肝細胞膜結構，導致肝細胞腫脹、壞死，MDA的含量可反映脂質過氧化的程度[11]。本研究中，CCl4損傷組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高、SOD及GSH-Px活性明顯降低，說明肝細胞清除自由基的能力降低，而水飛薊素組、特女貞苷各給藥組小鼠肝組織中MDA含量明顯降低、SOD活力及GSH-Px活性明顯提高，提示特女貞苷具有一定的抗氧化作用，能有效提高細胞清除自由基的能力，減輕肝細胞在自由基攻擊下的損傷程度，其保肝作用可能與這種抗氧化作用有關。

急性肝損傷時肝臟不能有效清除內毒素，TNF-α、IL-1β和IL-6等是由肝Kupffer細胞表達和釋放的炎性細胞因子，這些炎性因子參與肝病免疫病理反應，從而加重肝臟損傷程度[12]。本研究中，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高，而特女貞苷可以明顯降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平，提示特女貞苷可能通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的釋放保護肝臟。

綜上所述，特女貞苷對CCl4誘導小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用，在本實驗設定的劑量范圍內，隨劑量增加對肝損傷的保護作用增強。肝組織病理學檢查結果也表明隨劑量增加肝臟損傷程度明顯減輕，特女貞苷200 mg·kg-1組的治療效果幾乎與水飛薊素組相當。研究結果表明其保肝作用機制可能與提高抗氧化酶的活性，清除自由基，減輕細胞在自由基攻擊下的損傷程度，降低炎癥因子的釋放有關。

(致謝：本實驗在第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院藥劑科新藥研發(fā)實驗室完成，全體作者均參與實驗，感謝第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院藥劑科提供的科研平臺，感謝實驗室主要參與人員陸楊師兄，房敏峰教授的幫助，感謝導師文愛東教授、王婧雯老師對該實驗及論文撰寫的悉心指導。)

[1]鄭禮勝，劉向前. 環(huán)烯醚萜類研究進展[J]. 天然產物研究與開發(fā)，2009，21(4)：702-11，25.

[1]Zheng L S，Liu X Q. Advances in the research of Iridoids[J].NatlProdResDeve，2009，21(4):702-11，25.

[2]薛存寬，何學斌，張書勤，等. 纈草環(huán)烯醚萜抗腫瘤作用的實驗研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2005，14(15):1969-72.

[2]Xue C K，He X B，Zhang S Q，et al. Experimental study of anti -tumor effect of valerian iridoids[J].ModJIntegrTradiChinWestMed，2005，14(15):1969-72.

[3]陸楊，胡冬梅，文愛東，等. 女貞總苷對急性肝損傷小鼠的保護作用[J]. 中國藥理學通報，2016，32(4):588-9.

[3]Lu Y，Hu D M，Wen A D，et al. The protective effect of privet total glycosides on acute liver injury mice[J].ChinPharmacolBull，2016，32(4):588-9.

[4]李陽，左燕，孫文基. 女貞子中2種主要裂環(huán)環(huán)醚萜苷成分的分離鑒定及其抗氧化活性研究[J]. 中藥材，2007，30(5):543-6.

[4]Li Y,Zuo Y,Sun W J. Study on antioxidant activity of two major Secoiridoid G lucosides in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait[J].JChinMedlMat，2007，30(5):543-6.

[5]Lin H M,Yen F L,Ng L T,et al. Protective effects of Ligustrum lucidum fruit extract on acute butylated hydroxytoluene-induced oxidative stress in rats[J].JEthnopharmacol，2007，111(1):129-36.[6]中國藥典. 一部[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:46.

[6]Chinese Pharmacopoeia Commission. Part I[S]. Beijng:China Medical Science Press. 2015:46.

[7]Liu S，Lv X H，Sun Z X，et al. Hepatoprotective and antioxidant effects of baicalin against CCl4-induced hepatotoxicity[J].JChinPharmSci，2015，24(8):538-44.

[8]丁傳波，趙婷，李永娟，等. 山荊子葉提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報，2013，29(11):1627-8.

[8]Ding C B, Zhao T, Li Y J，et al. Protective effect of ethanol extract of Malus baccata leaves on carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].ChinPharmacolBull，2013，29(11):1627-8.

[9]孫曉晶，王允，王毅剛，等. 蘇肝清對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 中藥材，2010，33(1):105-8.

[9]Sun X J，Wang Y，Wang Y G，et al. Protective effects of Su Gan Qing against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].JChinMedMat，2010，33(1):105-8.

[10]蔡曉波，陸倫根. 谷胱甘肽過氧化物酶與肝臟疾病[J]. 世界華人消化雜志，2009，17(32):3279-82.

[10]Cai X B，Lu L G. Glutathione perox-idase and liver disease[J].WorldChinJDig，2009，17(32):3279-82.

[11]馮芹，夏文凱，王現(xiàn)珍，等. 連翹苷元對四氯化碳大鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報，2015，31(3):426-30.

[11]Feng Q，Xia W K，Wang X Z，et al. Effect of phillygenin on acute liver injury induced by CCl4in rats[J].ChinPharmacolBull，2015，31(3):426-30.

[12]Jaattela M. Biologic activities and mechanisms of action of tumor necrosis factoralpha/cachectin[J].LabInvest，1991，64(6):724-42.

Protective effects of specnuezhenide against carbon tetrachloride-induced acute hepatic damage in mice

HU Dong-mei1,2, LU Yang2, FANG Min-feng1, WANG Jing-wen2, WEN Ai-dong2

(1.KeyLaboratoryofResourceBiologicalandBiotechnologyinWesternChina,CollegeofLifeScience,NorthwestUniversity,Xi’an710069,China; 2.DeptofPharmacy,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

AimTo research the protective effects of specnuezhenide, an active compound of traditional Chinese medicine, against CCl4-induced hepatic damage in mice.MethodsThe model of acute hepatic damage caused by CCl4intraperitoneal injection on mice was obtained. The levels of ALT, AST, TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum, the activities of MDA, SOD, and GSH-Px in liver homogenates, and the histopathological organization of liver sections were also examined to observe the protective effects of specnuezhenide.ResultsSpecnuezhenide markedly decreased the CCl4-induced elevation of serum ALT and AST activities, and improved hepatic histopathology changes. Specnuezhenide also significantly decreased the content of MDA in liver tissues, meanwhile increased the activities of antioxidant enzymes SOD and GSH-Px. In addition, specnuezhenide reduced the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6.ConclusionsSpecnuezhenide has significant protective effects against CCl4-induced hepatic damage in mice, and the possible underlying mechanisms of the activity could be due to its antioxidant and anti-inflammatory effects.

specnuezhenide; CCl4; mice; acute hepatic damage; antioxidant; anti-inflammatory; hepatoprotective

2016-05-07,

2016-06-18

國家自然科學基金資助項目(No 81302627)

胡冬梅(1989-)，女，碩士生，藥師，研究方向：臨床藥學，E-mail：15388602172@126.com；

文愛東(1964-)，男，博士，博士生導師，研究方向:臨床藥學，通訊作者，E-mail：adwen@fmmu.edu.cn；

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.014

A

1001-1978(2016)09-1260-04

R-332;R284.1;R322.47;R575.053.1

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.028.html

王婧雯(1979-)，女，博士生，副主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向:臨床藥學，通訊作者，E-mail：wangjingwen8021@126.com